Roman Venetin

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 18497 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die vorliegende Forschung zeigt die Antitumoraktivität eines Protein-Polysaccharid-Komplexes Venetin-1, der aus der Zölomflüssigkeit von Dendrobaena veneta-Regenwürmern gegen A549-Krebszellen gewonnen wird. Die Untersuchungen sind eine Fortsetzung von Experimenten zur Antitumoraktivität der von dieser Art gewonnenen Zölomflüssigkeit. Das Venetin-1-Nanopartikel wurde nach thermischer Behandlung der Zölomflüssigkeit, Trennung von Zölomozyten, Filtration und Lyophilisierung erhalten. Das Präparat zeigte eine selektive Wirkung auf Krebszellen, während normale Zellen nicht betroffen waren. Venetin-1 war in Dosen von 31,3 und 62,5 µg/ml wirksam gegen Lungenkrebszellen, und die Ergebnisse wurden mittels Lichtmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie (REM) abgebildet. Die Zellen starben hauptsächlich über den Apoptoseweg. In der mikroskopischen Betrachtung traten sporadisch nekrotische Zellen auf. Die REM-Bildgebung zeigte eine vollständige Zerstörung der A549-Zellen nach der Inkubation mit Venetin-1. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM)-Analysen zeigten Veränderungen in der Topographie, Spitzenkraftfehlerbildern und dem Elastizitätsmodul (Elastizität) der A549-Zellen nach der Inkubation mit Venetin-1. Die Transmissionselektronen-Kryomikroskopie-Analyse (Cryo-TEM) zeigte einen polymeren Charakter des analysierten Präparats. Die Proben von Venetin-1 zeigten ein sehr homogenes Größenprofil mit einer Mikropartikelgröße von etwa 58,23 nm. Es wurde eine signifikante Abnahme der Venetin-1-Bindung an Sphingomyelin beobachtet. Venetin-1 verlor seine porenbildende Aktivität oder es kam zu einer Deaktivierung der porenbildenden Aktivität. Dies bestätigt das Fehlen einer hämolytischen Fähigkeit von Venetin-1 gegenüber roten Blutkörperchen. Die durchgeführten Analysen zeigen die Eignung des erhaltenen Komplexes für die biomedizinische Forschung. Der nächste Schritt besteht darin, die Wirkung von Venetin-1 auf das Immunsystem von Mäusen zu analysieren.

In der Gruppe der nicht übertragbaren Krankheiten sind Krebserkrankungen die häufigste Todesursache. Lungenkrebs weist weltweit die höchste Sterblichkeitsrate bei Männern und Frauen auf1,2. Zigarettenrauchen ist die häufigste Ursache für die Entstehung von Lungenkrebs. Tabakrauch enthält etwa 4000 Substanzen, von denen etwa 50 als giftig, reizend oder krebserregend eingestuft sind1,3,4. Auch Personen, die Passivrauchen ausgesetzt sind, sind gefährdet, an Lungenkrebs zu erkranken. Im Urin von Passivrauchern können die Metaboliten von Nikotin nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass Nichtraucher verschiedene Bestandteile des Tabakrauchs inhalieren3. Bestandteile des Tabakrauchs verursachen Störungen im Zellgenom, z. B. DNA-Deletion oder -Amplifikation, falsche Methylierung und sogar den Verlust oder die Zunahme ganzer Chromosomen2.

Obwohl 85 % der Lungenkrebserkrankungen bei Tabakrauchern auftreten, werden die anderen Fälle bei Personen diagnostiziert, die noch nie geraucht haben. Eine der nicht durch Tabak verursachten Ursachen für Lungenkrebs ist Luftverschmutzung, vor allem das Vorhandensein von Schwefelsauerstoff, Stickstoffsauerstoff oder Staub mit einem Durchmesser von weniger als 2,5 µm5,6. In den USA ist Radon die Hauptursache für Lungenkrebs, also das Produkt des Radiumzerfalls im Boden. Dieses Gas ist die Ursache für 40 % der Krebstodesfälle, und die meisten dieser Patienten sind lebenslange Nichtraucher1. Forscher haben auch Gene identifiziert, die für die Anfälligkeit für die Entwicklung von Lungenkrebs verantwortlich sind, z. B. Keimbahnmutationen in den p53- und EFGR-Genen, SNP-Genpolymorphismus oder Störungen in DNA-Reparaturgenen, z. B. ERCC12,7.

Lungenkrebs wird bei Menschen im Alter von etwa 70 Jahren diagnostiziert. Sie können in zwei Haupttypen eingeteilt werden: SCLC (kleinzelliges Lungenkarzinom) und NSCLC (nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom). Ungefähr 85 % der Lungenkrebserkrankungen sind NSCLC2. Aufgrund der späten Erkennung und des fortgeschrittenen Stadiums der Krebsentstehung haben sie oft eine schlechte Prognose8. SCLCs befinden sich häufig in größeren Atemwegen und verursachen Bronchialverschlüsse. Diese Krebsarten sind oft ziemlich groß und metastasieren oft in Lymphknoten9.

Es wurde dokumentiert, dass viele Verbindungen natürlichen pflanzlichen, pilzlichen oder tierischen Ursprungs Lungenkrebszellen zerstören können. Beispielsweise zeigte asiatischer Basilikumextrakt aus Ocimum sanctum Zytotoxizität gegenüber A549-Lungenkrebszellen, erhöhte die Sub-G1-Population und beeinflusste das Auftreten von apoptotischen Körpern in Krebszellen10. Andere Studien zeigten, dass Phyllanthus eine selektive Toxizität bei A549-Zellen hervorrufen konnte. Darüber hinaus übte es eine hemmende Wirkung in den kritischen Stadien der Metastasierung aus, einschließlich Migration und Invasion11. Ramalakshmi et al.12 wiederum fanden eine zytotoxische Aktivität des Ethanolextrakts aus Coleus amboinicus-Blättern gegen A549-Lungenkrebszellen. Seine Zytotoxizität nach 72-stündiger Inkubation mit A549-Lungenkrebszellen betrug 94 %.

Wei-Sheng et al.13 zeigten, dass Bostricin (Hydroxy-Methoxy-Tetrahydro-5-Methylanthracen) aus Meerespilzen die Proliferation von A549-Zellen in einer dosis- und inkubationszeitabhängigen Weise hemmte, den Zellzyklus bei G0/G1 stoppte und stimulierte Apoptose. Es wurde gezeigt, dass aus dem Pilz Theissenia rogersii isoliertes Pyknidion die Proliferation von A549-Lungenadenokarzinomzellen durch Zellzyklusstillstand in der G1-Phase reduziert. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass es die Apoptose über externe und interne Wege stimuliert. Pyknidion verursachte auch eine Verringerung des mitochondrialen Membranpotentials und einen signifikanten Anstieg des Gehalts an reaktiven Sauerstoffspezies und Protein PAI-1 in A549-Zellen14. In der chinesischen Medizin sind die krebshemmenden Eigenschaften von aus Ganoderma spp. isolierten Verbindungen bekannt. gegen Lungenkrebs sind allgemein bekannt15.

In Bezug auf Präparate tierischen Ursprungs zeigten Arulvasu et al.16, dass eine Sardinenölemulsion (Sardinella longiceps) dosis- und inkubationszeitabhängig Apoptose induzierte und die Proliferation von A549-Lungenkrebszellen hemmte. Der wahrscheinliche Wirkungsmechanismus von Ω-3-Säuren besteht in der Interaktion mit der Zellmembran und der Hemmung von Membranenzymen, was zur Apoptose neoplastischer Zellen führt. Bei Wirbellosen wurde beobachtet, dass Proteine ​​aus der Zölomflüssigkeit von Regenwürmern auch eine Antitumorwirkung zeigen, beispielsweise gegen Lungenkrebs17.

Regenwürmer sind eine Quelle krebshemmender Substanzen. Diese Ringelwürmer werden in der fernöstlichen Medizin, z. B. in Vietnam, China oder Korea, zur Behandlung vieler Krankheiten eingesetzt, z. B. Verbrennungen, Asthma, Bronchitis, Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder Magen-Darm-Geschwüre17,18. In ihrem Lebensraum, der über eine reiche Mikrobiota verfügt und einen ständigen Kontakt zwischen Mikroorganismen und Regenwürmern gewährleistet, haben diese Tiere Mechanismen entwickelt, die die Entstehung von Krankheiten verhindern18,19,20,21. Die beliebtesten Formulierungen aus Regenwürmern sind Pulver und Pasten20,21,22,23,24. Es wurde nachgewiesen, dass Zölomflüssigkeit reich an Proteinen, Enzymen, Peptiden und Polysacchariden ist. Es hat fibrinolytische Eigenschaften, übt gefäßrelaxierende Wirkungen aus und hat positive Eigenschaften für die Leber17,18,22. Regenwurmpräparate haben dokumentierte antibakterielle und antimykotische Eigenschaften20,21,24,25,26,27,28. Aktuelle Untersuchungen haben gezeigt, dass Zölomflüssigkeit eine krebshemmende Wirkung gegen die Krebszelllinien HeLa, A549, Pa17, PC-12 oder Hep-2 hat20,26,29. Es wurde ein Mechanismus der Wirkung der Zölomflüssigkeit gegen Krebszellen vorgeschlagen, der auf einer Einschränkung der Glukoseaufnahme durch Zellen beruht20. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Zölomflüssigkeit keine zytotoxische Wirkung auf menschliche Fibroblasten oder Erythrozyten hat25,30. Diese Eigenschaften machen aus Regenwürmern gewonnene Produkte zu vielversprechenden Wirkstoffen in der Krebstherapie.

Die Auswirkungen von Venetin-1 auf die Proliferation der BEAS-2B- und A549-Zellen wurden mithilfe des MTT-Assays für 24, 48 und 72 Stunden bestimmt (Abb. 1). Obwohl die A549-Zelllinie nach der 24- und 48-stündigen Exposition gegenüber den verschiedenen Venetin-1-Konzentrationen (15,6–500 μg/ml) zu etwa 80–90 % lebensfähig war, sank ihre Lebensfähigkeit nach der 72-stündigen Inkubation deutlich auf 52 % , 41 % und 32 % bei den Venetin-1-Konzentrationen von 125 μg/ml, 250 μg/ml bzw. 500 μg/ml (Abb. 1A). Die Lebensfähigkeit der BEAS-2B-Zellen sank in der mit 500 μg/ml Venetin-1 behandelten Gruppe nach 72 Stunden auf 75 % (Abb. 1B). Bei den niedrigeren Konzentrationen schienen die BEAS-2B-Zellen eine höhere Toleranz gegenüber Venetin-1 aufzuweisen, mit einer höheren Lebensfähigkeit (80–100 %) bei allen anderen Venetin-1-Konzentrationen nach dem 72-Stunden-Zeitraum.

Ergebnisse des MTT-Tests und Auswirkungen der angegebenen Konzentrationen von Venetin-1. (A) Dosis-Wirkungs-Kurven für Venetin-1 in A549-Zellen nach 24-stündiger, 48-stündiger und 72-stündiger Inkubation. (B) Vergleich der zytotoxischen Aktivität von Venetin-1 gegen Lungenkrebs-A549-Zellen und normale BEAS-2B-Zellen nach 72-stündiger Inkubation. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt. *p < 0,05; **p < 0,01. Venetin-1 verursachte bei einer Konzentration im Bereich von 125–500 μg/ml nach der 72-stündigen Inkubation eine signifikante Abnahme der Lebensfähigkeit der A549-Zellen, induzierte jedoch keine signifikanten Veränderungen in der Lebensfähigkeit der BEAS-2B-Zellen.

Der durch den Venetin-1-Extrakt induzierte apoptotische Zelltod wurde durch Überwachung der Phosphatidylserin (PS)-Translokation mithilfe des Annexin V-FITC/PI-Assays untersucht. Basierend auf der Fähigkeit von Annexin V, an PS zu binden, das im inneren Membranblatt lebensfähiger Zellen lokalisiert ist, wurden die Zellen wie folgt klassifiziert: LL – lebensfähige Zellen (Annexin V–/PI–), LR – frühe apoptotische Zellen ( Annexin V+/PI–), UR – späte apoptotische Zellen (Annexin V+/PI+) und UL – nekrotische (Annexin V–/PI+) Zellen.

Wir beobachteten, dass die 72-stündige Behandlung mit Venetin-1 eine nekrotische und apoptotische Wirkung auf die A549-Zellen hatte (Abb. 2). Die Anzahl lebensfähiger Zellen sank deutlich von 77,03 ± 2,62 % in der Kontrolle auf 48,41 ± 0,92 % nach der 72-stündigen Inkubation mit 125 µg/ml Venetin-1. Im Vergleich zu den Kontrollzellen wurde in den mit Venetin-1 behandelten A549-Zellen eine erhöhte Menge an nekrotischen (~ 5 %) und frühen apoptotischen Zellen (~ 3 %) beobachtet. Darüber hinaus zeigten die Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Zellen eine deutlich höhere späte Apoptoserate (24,31 ± 0,57 vs. 2,18 ± 0,27) (Tabelle 1). Die Ergebnisse der Aktivität von Venetin-1 gegen normale Lungenepithelzellen (BEAS-2B) sind in den Zusatzmaterialien dargestellt (Ergänzende Abbildung S1).

Apoptotische und nekrotische Aktivität von Venetin-1 in A549-Zellen, bewertet mit dem Annexin V/PI-Färbetest. Panel (A) zeigt repräsentative Punktdiagramme von A549-Kontrollzellen (ohne Inkubation mit Venetin-1) nach Doppelfärbung mit Annexin V-FITC und PI. Panel (B) zeigt die Auswirkungen einer 72-stündigen Inkubation mit Venetin-1 (125 µg/ml) auf die Zellapoptose in A549-Zellen. Die Zellen wurden in lebensfähige Zellen (Quadrat unten links), früh apoptotische Zellen (Quadrat unten rechts), spät apoptotische Zellen (Quadrat oben rechts) und nekrotische Zellen (Quadrat oben links) eingeteilt. Es werden repräsentative Bilder von drei unabhängigen Experimenten gezeigt. Venetin-1 hatte eine nekrotische und apoptotische Wirkung auf die A549-Zellen. Die Nekroserate sowie die frühe und späte Apoptose waren in den mit Venetin-1 behandelten A549-Zellen um 5 %, 3 % bzw. 22,13 % höher als in der Kontrolle.

Um die mögliche Wirkung der Venetin-1-Behandlung auf den Zellzyklus zu untersuchen, wurden die A549-Zellen 72 Stunden lang mit 125 µg/ml Venetin-1 behandelt, mit PI angefärbt und einer Durchflusszytometrieanalyse unterzogen. Wie in Abb. 3 gezeigt, wurden die behandelten A549-Zellen in der Sub-G1-Phase mit einem erheblichen Anstieg (p < 0,0001) der Anzahl apoptotischer Zellen (1,13 ± 0,08 % gegenüber 36,63 ± 0,61 %) angehalten. Die Inkubation mit Venetin-1 verursachte auch eine gleichzeitige Abnahme des Zellanteils an G1 (40,94 ± 0,94 % vs. 30,44 ± 0,57 %, p = 0,0001), S (25,56 ± 0,65 % vs. 18,36 ± 0,50 %, p). = 0,0001) und G2/M (31,36 ± 0,35 % vs. 15,32 ± 0,38 %, p < 0,0001) Phasen des Zellzyklus in den behandelten A549-Zellen im Vergleich zur Kontrolle.

Wirkung der Behandlung mit Venetin-1 auf die Phasen des A549-Zellzyklus. (A) Zellzyklusanalyse mittels Durchflusszytometrie in A549-Kontrollzellen und solchen, die 72 Stunden lang mit Venetin-1 (125 µg/ml) behandelt wurden. Die Zellzyklusverteilung PI-markierter Zellen wurde durch Durchflusszytometrieanalysen analysiert. Die Spitzen in der Abbildung entsprechen den Unterphasen G1 (Tor M1), G1 (Tor M2), S (Tor M3) und G2/M (Tor M4) des Zellzyklus. (B) Histogramm, das den Prozentsatz der Zellen in jeder Phase des Zellzyklus zeigt. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte ± SD aus drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. P-Werte unter 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01) im Vergleich zur Kontrollgruppe gelten als statistisch signifikant. Die Venetin-1-Behandlung verursachte einen Stillstand der A549-Zellen in der Sub-G1-Phase mit einem Anstieg der Anzahl apoptotischer Zellen und einer sichtbaren Verringerung der Anteile der behandelten und Kontroll-A549-Zellen in den anderen Zellzyklusphasen.

Der Spiegel der Caspasen 3, 6, 8, 9, 12 und 18 wurde in Homogenaten normaler und neoplastischer Zellen mit und ohne Venetin-1 bestimmt (Abb. 4). In der Kultur der A549-Lungenkrebszellen war der Spiegel jeder der getesteten Caspasen in den mit Venetin-1 in einer Konzentration von 125 µg/ml ergänzten Kulturen höher als in den unbehandelten Kulturen. Der Caspasespiegel in der Kultur der normalen BEAS-2B-Zellen mit der Zugabe von Venetin-1 in einer Konzentration von 125 µg/ml unterschied sich zwischen den beiden untersuchten Gruppen nicht signifikant.

Konzentrationen der Caspasen 3, 6, 8, 9, 12 und 18 in BEAS-2B- und A549-Zellkulturen. *p < 0,05. Der größte Anstieg der Konzentration der getesteten Caspasen wurde in der Kultur der mit Venetin-1 behandelten A549-Lungenkrebszellen beobachtet.

Nach der Inkubation mit Venetin-1 (125 µg/ml) wurde der stärkste Anstieg der Konzentration der Caspasen 3, 6, 8 und 9 in der Kultur der A549-Lungenkrebszellen verzeichnet. Der höchste Anstieg der Caspase-12-Konzentration wurde in der A549-Lungenkrebszellkultur verzeichnet, die mit dem Wirkstoff inkubiert wurde (Abb. 4). Bei der Zugabe von Venetin-1 (125 µg/ml) wurde in der Kultur von BEAS-2B-Zellen eine leichte Abnahme der Konzentration von Caspase 12 festgestellt. Der stärkste Anstieg der Konzentration von Caspase 18 nach der Inkubation mit Venetin-1 wurde in der Kultur der A549-Lungenkrebszellen festgestellt. In der Kultur normaler Zellen, die mit Venetin-1 inkubiert wurden, wurde ein leichter Rückgang der Konzentration von Caspase 18 beobachtet. Vollständige Daten finden Sie in den Zusatzmaterialien (Ergänzungstabelle S2).

Die Analyse der A549-Kontrollkultur und der mit 62,5 und 125 µg/ml Venetin-1 inkubierten Varianten zeigte, dass die mit der aktiven Fraktion behandelten Zellen unter der Linse weniger deutlich sichtbar waren und deformiert waren. In den Zellen wurden häufig zytopathische Veränderungen beobachtet. Darüber hinaus waren stark degradierte oder zerfallende Zellen sichtbar (Abb. 5a).

Visualisierung von mit Venetin-1 behandelten A549-Zellen mithilfe von Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie: (a) zytotoxische Wirkung von Venetin-1 auf A549. A – A549-Kontrollkultur, B – A549 nach 72-stündiger Inkubation mit Venetin-1 (62,5 µg/ml) bei 78 % Zytotoxizität; C1, C2 – A549 nach 72-stündiger Inkubation mit Venetin-1 (125 µg/ml) bei 48 % Zytotoxizität. Die Zellen wurden mit einem Zeiss Axiovert 40CFL-Mikroskop (Carl Zeiss) sichtbar gemacht. Der Maßstabsbalken entspricht 20 µm. Die Bilder repräsentieren 10 Bilder. Die mit Venetin-1 behandelten Zellen wurden deformiert und abgebaut; (b) apoptotische und nekrotische Wirkungen auf A549-Zellen nach 72-stündiger Inkubation mit Venetin-1. A – Kontrollkultur von A549, B – A549-Zellen, behandelt mit Venetin-1 (62,5 µg/ml), C1, C2 – A549-Zellen, behandelt mit Venetin-1 (125 µg/ml). Die gelben Pfeile zeigen apoptotische Zellen mit deutlich fortschreitender Degeneration des Zellkerns. Die rosafarbenen Zellen gelten als nekrotisch. Die Maßstabsbalken entsprechen 50 µm. Jedes Bild stellt 10 aufgenommene Fotos dar.

Unter dem Durchlichtmikroskop beobachtete Kulturen wurden auch mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet, nachdem eine Mischung aus Fluoreszenzfarbstoffen aufgetragen wurde, um nekrotische und apoptotische Zellen zu identifizieren. Die Kontrollzellen zeichneten sich durch einen regelmäßig dunkel fluoreszierenden Zellkern aus. Zellen, die mit Venetin-1 in Konzentrationen von 62,5 und 125 µg/ml inkubiert wurden, hatten hell leuchtende Kerne mit häufig fragmentiertem genetischem Material. Zellen, die Anzeichen einer Apoptose aufweisen, sind im Bild mit Pfeilen markiert. Nekrotische Zellen waren sporadisch und emittierten rote Fluoreszenz (Abb. 5b).

Die Kontrollkultur und die mit Venetin-1 in einer Konzentration von 125 µg/ml inkubierten Zellen wurden mit der DIC-Technik beobachtet. Die Technik sorgt für den Effekt einer dreidimensionalen Oberfläche. Es wurde beobachtet, dass die Kontroll-A549-Zellen in der mikroskopischen Ansicht sichtbar dichter und kompakter waren, was durch ihre dunklere Farbe und größere Diversität der beobachteten Oberfläche angezeigt wurde (Abb. 6a A). Nach der Venetin-1-Behandlung kontrahierten die Zellen, was durch die konzentrierte dunkle Pigmentierung auf der Zelloberfläche näher an ihrem Zentrum sichtbar wurde (Abb. 6a B1, B2). Die Rasterelektronenmikroskopie der Tumorzellen erleichterte den Vergleich ihrer Oberflächen zwischen der Kontrollgruppe und der Venetin-1-Inkubationsgruppe (125 µg/ml). Die Oberfläche der Kontrollzellen war reich an feinkörnigen Strukturen (Abb. 6a A1, A2), wohingegen die mit Venetin-1 behandelten Zellen diese Körnchen nicht aufwiesen und ihre Zelloberfläche Reste beschädigter Strukturen aufwies (Abb. 6b B1, B2). ). Der Zellkontraktionseffekt war auch als erkennbare Risse im mikroskopischen Bild sichtbar (Abb. 6b B1).

DIC- und SEM-Analyse von A549-Zellen nach Exposition gegenüber Venetin-1: (a) DIC-Bilder von A549-Zellen nach Venetin-1-Behandlung A – Kontrollkultur von A549 B1, B2 – A549-Zellen nach Inkubation mit Venetin-1 (125 µg/ml). ). Die Maßstabsbalken entsprechen 20 µm. (b) REM-Bilder der Oberfläche von A549-Zellen nach Venetin-1-Behandlung. A1, A2 – Kontrollkultur von A549, B1, B2 – A549-Zellen nach Inkubation mit Venetin-1 (125 µg/ml). Die Maßstabsbalken entsprechen 10 µm. Nach der Inkubation mit Venetin-1 waren an der Oberfläche der A549-Zellen Kontraktion und Abbau der Zellstrukturen sichtbar. Jedes Bild stellt 10 aufgenommene Fotos dar.

Die von AFM auf der Oberfläche der mit 125 µg/ml Venetin-1 inkubierten A549-Zellen aufgenommenen topografischen und Spitzenkraftfehlerbilder zeigten Unterschiede (Abb. 7B1, B2) zu den Kontrollzellen (Abb. 7A1, A2). Die mittlere Amplitude der A549-Kontrollzellen, die der Höhenmessung unterzogen wurden, war zweifach niedriger als die mittlere Amplitude der mit Venetin-1 behandelten Zellen. Die mit Venetin-1 inkubierten A549-Zellen hatten eine deutlich unterschiedliche Oberfläche mit sichtbaren Vertiefungen im Höhenprofil (Abb. 7B1, B2). Um Zelloberflächenbereiche mit der niedrigsten und größten Elastizität zu bestimmen, wurde eine Karte des Elastizitätsmoduls erstellt und die Werte des Elastizitätsmoduls für die angegebenen Bereiche verglichen. Der Durchschnittswert des Elastizitätsmoduls der Bereiche mit der größten Elastizität betrug 2120,7 MPa in der Kontrolle und 1142,8 MPa in den mit Venetin-1 behandelten A549-Zellen. Der Elastizitätsmodul der Bereiche mit der geringsten Elastizität war in den mit Venetin-1 inkubierten A549-Zellen 2,3-mal niedriger (2647,4 MPa) als in den Kontrollzellen (6300,9 MPa). In beiden Fällen waren die Unterschiede statistisch signifikant (p < 0,001; Student's T-Test). Die AFM-Bilder zeigten apoptotische morphologische und biophysikalische Veränderungen in den A549-Zellen, die durch die Venetin-1-Behandlung verursacht wurden.

AFM-Analyse der A549-Zellwandoberfläche. (A1, A2) Kontrollkultur von A549, (B1, B2) Krebszellen, inkubiert mit 125 µg/ml Venetin-1. Bild der großen Höhe und des Spitzenkraftfehlers – linkes Feld; Höhenprofil und 3D-Bild – rechter Bereich. Die Behandlung mit Venetin-1 verursachte Veränderungen in der Zellwandtopographie und den mechanischen Eigenschaften der A549-Zellen, und es wurde eine deutlich geringere Elastizität, ausgedrückt als Elastizitätsmodul, beobachtet.

Vor dem enzymatischen Aufschluss der Proteinkomponenten von Venetin-1 und DVr (rohe Zölomflüssigkeit) wurden die Proben mit DTT reduziert und einer elektrophoretischen Trennung im automatischen SageELF-System unterzogen. Proteine ​​wurden im größenbasierten Modus im Bereich von 10–300 kDa getrennt. Nach der Trennung eluierte das System die Proteine ​​automatisch aus dem Gel in separate Vertiefungen in der Kassette, von wo aus sie in Eppendorf-Röhrchen pipettiert und gemäß dem FASP-Protokoll verdaut wurden (jede Fraktion separat). Die Proteinidentifizierungsergebnisse für Venetin-1 in jeder Fraktion sind in Tabelle 2 dargestellt (alle Ergebnisse sind in den Zusatzmaterialien, Tabelle S3 für Venetin-1 und S4 für rohe Zölomflüssigkeit DVr, verfügbar). Die Identifizierung erfolgte auf Basis der überarbeiteten Proteindatenbank für Annelida (Uniprot).

Die Bindung des Venetin-1-Präparats und seines Vorläufers DVr (rohe Zölomflüssigkeit), die von Regenwürmern gesammelt und unverarbeitet (ohne Erhitzen und Dialyse) an zwei Lipide: Sphingomyelin und POPC, wurde bestimmt. 3-mM-Liposomenlösungen wurden gemäß dem im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Lipide wurden auf dem L1-Sensor abgelagert, der die Interaktion von Proteinen mit Lipiden untersuchen soll. Anschließend wurde nach Blockierung des Sensors mit einer Albuminlösung der Vorgang der Bindung beider Präparate durchgeführt, die gebundenen Proteine ​​wurden eluiert und einer Proteomanalyse unterzogen. Die in Abb. 8 dargestellten Sensorgramme zeigen die Bindung der Präparate an Lipide. Im Vergleich zum unverarbeiteten DVr-Präparat kam es zu einer signifikanten Verringerung der Venetin-1-Bindung an Sphingomyelin. Es wurde eine geringere Bindung von DVr an das POPC-Lipid festgestellt. Die Venetin-1-Bindung an POPC war schwächer und ging mit einer schnellen Ablösung vom Komplex einher.

SPR-Analyse von Proteinextrakten (DVr – rohe Zölomflüssigkeit und Venetin-1), die an SM (Sphingomyelin) und POPC (1-Palmitoyl-2-deoylphpsphatydilcholin) binden. Die beobachteten Veränderungen standen im Zusammenhang mit der Verringerung der Venetin-1-Bindung an Sphingomyelin im Vergleich zum unverarbeiteten DVr-Präparat, der geringeren Bindung von DVr an das POPC-Lipid und der schwächeren Bindung von Venetin-1 an POPC.

Die proteomische Analyse der Gewinnungsfraktionen aus den SPR-Experimenten ergab, dass jeweils nur ein Protein identifiziert wurde, nämlich Lysenin-verwandtes Protein 2 (LRP2). Die höchste Sequenzabdeckung und die meisten Peptide wurden in DVr identifiziert. Einzelheiten finden Sie in Tabelle S5 in den Zusatzmaterialien.

Der Wirkstoff Venetin-1 war unter dem Rastermikroskop als kleine Flocken unterschiedlicher Größe sichtbar. Die längsten Strukturen waren etwa 200 µm lang (Abb. 9A1, A2). Die Struktur des Präparats wurde auch mit der Cryo-TEM-Technik beobachtet. Es wurde festgestellt, dass sich die kleineren Strukturen zu einer größeren kreisförmigen Struktur zusammenballten. Die Anhäufung kleinerer Strukturen wird durch den weißen Kreis in Abb. 9B angezeigt, während die losen Strukturen durch Pfeile angezeigt werden. Im oberen Teil des Exemplars ist eine kompakte, runde Form erkennbar. Das beobachtete Bild legt nahe, dass die Venetin-1-Struktur charakteristisch für eine Polymerverbindung ist.

Bildgebung von Venetin-1: (A1, A2) REM-Bilder von Venetin-1; (B) Kryo-TEM-Bildgebung von Venetin-1. Das Bild zeigt kleine Strukturen, die zu einer größeren gruppiert sind (markiert mit einem weißen Kreis). Lockere Strukturen sind mit Pfeilen markiert. Im oberen Teil des Bildes ist eine dunkle, kreisförmige, kompakte Struktur aus kleineren Partikeln zu erkennen.

Die Analyse ergab das Vorhandensein von Kohlenstoff (64,1 %), Sauerstoff (23,5 %), Stickstoff (6,3 %), Phosphor (1,6 %) und Schwefel (0,3 %). Alle diese Elemente sind charakteristisch für Proteine. Die Tests zeigten auch das Vorhandensein von Chlor (3,0 %) und Natrium (1,3 %).

Das XPS-Vermessungsspektrum von Venetin-1 ist in Abb. 10 dargestellt. Die quantitativen Ergebnisse der XPS-Analyse der Elementzusammensetzung der Venetin-1-Oberfläche sind in Tabelle 3 dargestellt.

XPS-Vermessungsspektrum von Venetin-1. Es wurden für Proteine ​​charakteristische Elemente nachgewiesen, darunter: Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel; zusätzlich wurde die Anwesenheit von Chlor und Natrium nachgewiesen.

Um die im analysierten Präparat vorhandenen chemischen Bindungen zu identifizieren, wurden Spektren in einem engen Bereich der Bindungsenergien für Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor aufgenommen. Nach einem Pick-Fitting-Vorgang auf der Grundlage der Literaturdaten wurden die chemischen Bindungen an die einzelnen Bindungsenergien angepasst. Abbildung 11 zeigt die Spektren in einem engen Bereich der XPS-Bindungsenergie. Tabelle 4 zeigt die Elementzusammensetzung von Venetin-1 mit Identifizierung charakteristischer chemischer Bindungen.

XPS-Spektren von Venetin-1 in einem engen Bereich von Bindungsenergien für: (a) Kohlenstoff, (b) Sauerstoff, (c) Stickstoff, (d) Phosphor, (e) Schwefel.

Die Studie zeigte die Bindungseigenschaften sowohl von Polysacchariden als auch von Proteinen. Die Spektren im engen Bereich der Bindungsenergien für Kohlenstoff zeigten das Vorhandensein von C-C-, C-H-, C-OH-, C=O- und C-O-C-Bindungen in den Polysacchariden. Das Vorhandensein der für Proteine ​​charakteristischen O=C-OH-Carboxylbindung wurde ebenfalls beobachtet. Es wurden auch die für die Peptidbindung charakteristischen C=O- und C-N-Gruppen gefunden. Die im für Stickstoff charakteristischen engen Bindungsenergiebereich durchgeführten Tests zeigten das Vorhandensein von Stickstoff in Form von Aminbindungen. Diese Bindungen sind charakteristisch für Proteine. Das Vorhandensein der organischen Form von Phosphor und Schwefel bestätigt auch das Vorhandensein von Proteinen im getesteten Präparat.

Wie in Abb. 12 und Tabelle 5 zu sehen ist, weisen die Proben ein sehr homogenes Größenanalyseprofil auf, wobei die Mikropartikelgröße zu 58,23 ± 3,93 nm bestimmt wurde.

Prometheus Panta DLS-Größenanalyse von Venetin-1-Mikropartikeln. Das Präparat erwies sich im Größenprofil als homogen.

Im Anschluss an die mit Prometheus Panta durchgeführte Größenanalyse wurde ein Schmelztemperaturexperiment mit einem Temperaturgradienten von 25 bis 95 °C und einer Heizrampe von 1 °C/min durchgeführt (Tabelle 6). Wie in Abb. 12 gezeigt, zeigten die Mikropartikel einen einzelnen 350/330-nm-Übergang bei einer Temperatur von 64,95 ± 0,08 °C. Dieser Übergang entsprach sehr wahrscheinlich dem Schmelzpunkt der analysierten Mikropartikel. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die analysierten Mikropartikel nach der Konformationsänderung, die durch das Fluoreszenzverhältnis 350/330 nm dargestellt wird, eine Aggregation mit Tagg bei 66,92 ± 0,16 °C und einem Aggregationsbeginn bei 58,97 ± 1,15 °C durchliefen.

Erneuerbare Quellen für Arzneimittel tierischen Ursprungs, darauf basierende pharmazeutische Präparate und biologische Lebensmittelzusatzstoffe scheinen ein wesentlicher Bestandteil des Fortschritts bei der Suche nach wirksamen Therapeutika zu sein. Diese Art menschlicher Aktivität sollte auf jede erdenkliche Weise verbessert werden. Praktische Tiermodelle tragen zur Entwicklung der Komplementär- und Alternativmedizin, der sogenannten integrativen Medizin, bei. Wirbellose Tiere wie Regenwürmer sind kostengünstig, ethisch unbestritten und nützlich für das Verständnis der Mechanismen, die biologischen Prozessen zugrunde liegen37. Die Verwendung von aus Regenwürmern gewonnenen Arzneimitteln ist in China und anderen asiatischen Ländern als grüne Medizin weit verbreitet. Aus diesen Wirbellosen hergestellte Extrakte werden zur Behandlung vieler Krankheiten eingesetzt. Unter den Wirbellosen sind Regenwürmer eine bekannte Quelle antibakterieller, antimykotischer und krebshemmender Verbindungen. Die Zölomflüssigkeit der Körperhöhle des Regenwurms weist viele Arten biologischer Eigenschaften auf, z. B. antimikrobielle, proteolytische, hämolytische, hämagglutinierende, antimykotische und antitumorale Wirkung.

Unsere Forschung zeigt, dass Venetin-1, das zuvor als Protein-Polysaccharid-Fraktion aus der Zölomflüssigkeit des Regenwurms D. veneta charakterisiert wurde, eine selektive Wirkung auf A549-Lungenkarzinomzellen hat, Krebszellen zerstört und normale Zellen rettet. Das Präparat wurde durch mehrere Prozesse gewonnen, wie z. B. Extraktion der Flüssigkeit mittels Elektroschock, Zentrifugation, Filterung, Inkubation und Lyophilisierung. Ein besonders wichtiger Schritt bestand darin, der Flüssigkeit ihre Zytotoxizität für normale Zellen zu entziehen und gleichzeitig ihre hohe Aktivität gegen Tumorzellen aufrechtzuerhalten. Diese Prozesse wurden in der Veröffentlichung beschrieben, die die Wirkung von Fraktionen aus Zölomflüssigkeit auf A549-Lungenkrebszellen beschreibt29.

Das erhaltene Präparat führte zum apoptotischen Zelltod. Aus Sicht der modernen Onkologie ist die Apoptose ein sehr wichtiger Prozess, der in Krebszellen aktiviert werden muss. Krebszellen sind von Natur aus unsterblich. Moderne Medikamente sollen so entwickelt werden, dass sie Apoptose (oder eine andere Art von Zelltod) nur in abnormalen Zellen auslösen und gesunde Zellen im Körper intakt lassen. Mit anderen Worten: Der Tumor wird pharmakologisch zum Selbstmord veranlasst. Die Auslösung des Apoptoseprozesses ist eines der Hauptziele der entwickelten Krebstherapien. Dies hängt mit den entwickelten Mechanismen der Resistenz von Tumorzellen gegen den programmierten Tod zusammen. Aktuelle Chemotherapeutika töten Krebszellen hauptsächlich durch die Induktion von Apoptose ab. Sie werden jedoch unwirksam, wenn die neoplastische Zelle metastasieren kann, was mit einer schlechten Prognose und einer hohen Mortalität verbunden ist38. Krebszellen weisen in der Regel mehrere Genmutationen auf, die den apoptotischen Prozess beeinflussen und so den programmierten Zelltod verhindern. Diese Apoptoseresistenz kommt metastatischen Zellen zugute38,39,40,41,42.

Zielproteine ​​werden durch Caspasen proteolysiert, was zu ihrer Aktivierung oder Hemmung führen kann und dadurch einen erheblichen Einfluss auf das zukünftige Schicksal der Zelle hat. Sie erfüllen viele wichtige Funktionen im Organismus. Diese Proteine ​​spielen vor allem eine Schlüsselrolle bei der Apoptose. Darüber hinaus sind sie an anderen Zelltodmechanismen wie Pyroptose, Nekrose und Autophagie beteiligt. Sie sind auch wichtig für die Funktion des Immunsystems und bei Entzündungsprozessen, indem sie die Sekretion entzündungsfördernder Zytokine stimulieren. Sie sind auch an Alterungsprozessen beteiligt. Einige Caspasen haben krebshemmende Eigenschaften43,44,45,46,47. Initiator-Caspasen (Caspasen 2, 8, 9 und 10) sind an der Anfangsphase der Apoptose beteiligt und haben die Aufgabe, das Todessignal zu verstärken. Sie sind auch für die Aktivierung von Effektor-Caspasen (Caspasen 3, 6, 7) verantwortlich. Nach der Aktivierung wiederum bauen Executor-Caspasen zelluläre Elemente schnell ab43,47,48.

Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass Venetin-1 einen statistisch signifikanten Anstieg der Caspase-Aktivität in kultivierten A549-Lungenkrebszellen verursacht. Der Anstieg der Konzentration von Caspase 3, das zur Gruppe der Executor-Caspasen gehört, und die Abnahme der Anzahl lebender Zellen in der Kultur können auf eine Intensivierung des Apoptoseprozesses in diesen Tumorzellen nach der Zugabe von Venetin-1 hinweisen. Der Anstieg von Caspase 12 lässt jedoch darauf schließen, dass dieses Präparat auch bei der Auslösung des Entzündungsprozesses wichtig sein könnte. Der Anstieg der Konzentration von Caspase 6 weist darauf hin, dass Venetin-1 die Ausführungsphase der Apoptose beeinflusst, und der Anstieg der Konzentration der Caspasen 8 und 9 spiegelt deren Einfluss auf die Initiationsphase wider. Nach der Zugabe von Venetin-1 in der Kultur normaler Zellen des Bronchialepithels des BEAS-2B-Bronchialbaums wurden wiederum keine signifikanten Veränderungen der getesteten Parameter festgestellt.

Die Lichtmikroskopie-, Rasterelektronenmikroskopie- und Rasterkraftmikroskopie-Beobachtungen zeigten Veränderungen in der Morphologie und den nanomechanischen Eigenschaften der Tumorzellen nach der Inkubation mit Venetin-1. Die mikroskopischen Bilder der verschiedenen Techniken ergänzten sich gegenseitig. Die Durchlichtmikroskopie zeigte eine Abnahme der Zelldichte und Verformung nach der Inkubation mit dem Wirkstoff. Veränderungen der A549-Zelloberflächenparameter, wie z. B. die Rauheit, wurden durch Rasterkraftmikroskopie nachgewiesen. Die frühe Apoptose ist durch eine Umgestaltung des Zytoskeletts und des Zellkerns gekennzeichnet. Es induziert dynamische Veränderungen der nanomechanischen Eigenschaften der Zelloberfläche49. Makroskopisch wurde die Verringerung der Kulturdichte auch durch die DIC-Technik nachgewiesen.

Das isolierte Venetin-1 verursachte einen signifikanten Anstieg der Caspasen 3, 12 und 18 in den A549-Lungenkrebszellen und induzierte gleichzeitig Veränderungen in der Lebensfähigkeit und Dichte der Zellen in diesen Kulturen. Dies weist darauf hin, dass dieses Präparat seine Antitumorwirkung entfaltet, indem es den Apoptoseprozess in A549-Lungenkrebszellen stimuliert.

Obwohl wir unser Präparat als Protein-Polysaccharid-Fraktion beschreiben, handelt es sich tatsächlich um einen Komplex, da frühere elektrophoretische Analysen davon zeigten, dass die von Proteinen kommenden Signale genau an den gleichen Positionen lokalisiert waren wie die von Zuckern kommenden Signale. Dies weist darauf hin, dass diese Protein- und Zuckerverbindungen miteinander verwandt sind. Darüber hinaus bewiesen FTIR-spektroskopische Analysen die chemische Homogenität des Präparats, da das FTIR-Spektrum in jedem analysierten Bereich gleich aussah und die gleiche Intensität aufwies. Eine weitere Beobachtung, die die Natur des Komplexes stützt, ist das Kryo-TEM-Bild des Präparats, das deutlich die Verschmelzung identischer kleinerer Strukturen zu einer größeren Kugelform zeigte. Die XPS-Analysen der chemischen Bindungen bestätigen diese Theorie. Darüber hinaus zeigten die mit Prometheus Panta durchgeführten domänenspezifischen Analysen der dynamischen Lichtstreuung, dass es sich bei Venetin-1, das zuvor als Protein-Polysaccharid-Fraktion galt, um ein Nanopartikel handelte.

Frühere chemische Analysen, die in Studien zur antimykotischen Aktivität27,28,30 durchgeführt wurden, zeigten, dass Proteine ​​der Lysenin-Familie: Lysenin-verwandtes Protein 2 (LRP2) und Lysenin, die mit einer Genauigkeit von 95 % bzw. 90 % Sequenzabdeckung identifiziert wurden, waren die Hauptbestandteile von Venetin-1. Lysenin ist ein 33-kDa-Protein, das in der Zölomflüssigkeit von Regenwürmern vorkommt50. Wahrscheinlich wird Lysenin von Coelomozyten und freien Chloragozyten produziert, da in diesen Zellen Lysenin-mRNA gefunden wurde. Lysenin bindet spezifisch an Sphingomyelin (SM) und bildet bei Bindung an die Zellmembranen von Zielzellen MS-abhängig Oligomere. Diese Proteine ​​gehören zur Gruppe der porenbildenden Toxine, die möglicherweise für die biologische Aktivität des Präparats verantwortlich sind.

Zur Trennung der Proteinkomponenten von DVr und Venetin-1 wurde das SageELF-System (Electrophoretic Lateral Fractionation) verwendet. Es dient der Proteinfraktionierung in einer SDS-Agarose-Gelmatrix bei gleichzeitiger Elution. Die Software steuert die Fraktionierungszeit basierend auf dem Signal des während der Probenvorbereitungsschritte hinzugefügten Fluoreszenzmarkers. Auf diese Weise wurden die erhaltenen Fraktionen entsprechend der Molekülgröße von 10 bis 300 kDa aufgeteilt. Die Proteomanalyse bestätigte das Vorhandensein erheblicher Mengen an Bestandteilen in allen Eluaten. Im Fall von Venetin-1 besteht der größte Anteil in Fraktion 9 (eluiert von 8 bis 10) aus der Monomerform von Lysenin, Aktin 2 und Lysenin-verwandtem Protein 2. Es ist jedoch nicht die einzige im Ganzen vorhandene Form Vorbereitung. Eine hohe Häufigkeit dieser Form, geschätzt durch die PeaksStudio-Programmparameter (Ergänzungstabelle S3), wurde in Fraktionen mit höherem Molekulargewicht beobachtet, aus denen Moleküle mit einem Gewicht von etwa 260 kDa (Fraktion 1) bis 100 kDa (Fraktion 4) eluiert wurden. Unter der Annahme, dass die Masse des Monomers der Masse von Lysenin oder LRP2 (33/34 kDa) entspricht, kann es sich um Trimer- bis Oktamerformen handeln, wenn es sich um homogenes Lysenin handelt, oder um heterogene LRP2-Oligomere als Mischung aus Lysenin und LRP2. Ihre Sequenzen sind sehr ähnlich (Identität 89 %). Aufgrund des Vorhandenseins von Aktin 2 (42 kDa) und z. B. Ubiquitin-Fragmenten, die in allen Fraktionen identifiziert wurden, wird auch angenommen, dass es sich um einen Multiproteinkomplex handelt. Die Sensorgrammanalyse ergab Unterschiede zwischen Venetin-1 und DVr in der Interaktion mit Lipiden. Die Daten für DVr stimmen mit Literaturberichten überein, die darauf hinweisen, dass Lysenine Proteine ​​sind, die Sphingomyelin spezifisch erkennen51. Im Fall von Venetin-1 wurde eine deutliche Abnahme der Bindung an Sphingomyelin beobachtet. Dies kann darauf hindeuten, dass die Fähigkeit, die für dieses Protein charakteristischen vollständigen Poren zu bilden, verloren geht oder dass sich beim Erhitzen der rohen Zölomflüssigkeit nicht-funktionelle Oligomere bilden. Venetin-1 kann immer noch mit SM interagieren, aber die Wechselwirkung ist viel schwächer. Dies ist auch im Fall von POPC sichtbar, das Säugetiermembranen imitiert. DVr hat eine schwächere Wirkung als SM, bei Venetin-1 ist die Wechselwirkung jedoch noch schwächer. Die Identifizierung von Proteinen aus der Gewinnungsfraktion ergab, dass Lysenin-verwandtes Protein 2 für beide getesteten Präparate ein Lipid-bindendes Protein ist. LRP-2 weist eine Identität von 89 % und eine Ähnlichkeit von 94 % mit der Lyseninsequenz auf, und Literaturdaten deuten darauf hin, dass LRP an SM bindet und die Hämolyse roter Blutkörperchen induziert, ebenso wie Lysenin51. Strukturell haben sie mutmaßliche N-Glykosylierungs- und N-Myristoylierungsstellen gemeinsam. Die Ergebnisse zeigen, dass die Interaktion von Venetin-1 mit Lipiden auf LPR2, nicht jedoch auf Lysenin beruht.

Venetin-1 verlor seine porenbildende Aktivität oder es kam zu einer Deaktivierung der porenbildenden Aktivität. Dies wurde durch die fehlende hämolytische Kapazität von Venetin-1 gegenüber roten Blutkörperchen bestätigt und zeigte eine signifikante Verringerung der Venetin-1-Toxizität gegenüber gesunden Zellen und das Fehlen einer Hämolyse von Erythrozyten im Vergleich zum DVr-Präparat. Die DVr-Fraktion baute Erythrozyten ab, während ihre Inkubation mit Venetin-1 diese Zellen nicht veränderte und keine Freisetzung ihres Inhalts verursachte (Daten im Manuskript nicht aufgeführt). Daher kann die Wechselwirkung von Monomeren oder Oligomeren mit der Membranoberfläche ohne Bildung von Poren und Membranperforationen bei Krebszellen analog sein. Der Porenbildungsprozess besteht aus drei Hauptschritten im Kontakt mit der Membran: Bindung löslicher Monomere an die Membran, Zusammenbau/Oligomerisierung und vollständiger Einbau der Porenform in die Lipidmembran52,53. Venetin-1 bindet Monomere oder möglicherweise lösliche Oligomere an die Membran, die anderen beiden Schritte scheinen jedoch irgendwie gehemmt zu sein.

Nach dem aktuellen Stand des medizinischen Wissens besteht weiterhin Bedarf an der Entwicklung neuer Arzneimittel, die allein oder synergistisch mit anderen Arzneimitteln wirksam gegen nichtkleinzelligen Lungenkrebs wirken. Lungenkrebs gehört zu den Neoplasien mit einer sehr schlechten Prognose, da er oft zu spät diagnostiziert wird. Grundlage für die Behandlung der meisten Krebsarten ist eine Kombinationstherapie, also der Einsatz chirurgischer Techniken, Strahlentherapie und Chemotherapie. Die Art der Therapie hängt vom Tumorstadium und der Gesamteffizienz des Patienten ab. Während einer Krebserkrankung und einer Chemotherapie kann sich beim Patienten als schwerwiegende Komplikation eine Pilzinfektion entwickeln. In diesem Fall ist es sehr wichtig, sowohl die Wirkung von Antikrebs-Zytostatika als auch deren Wechselwirkungen mit Antimykotika zu kennen. In der Onkologie eingesetzte Chemotherapeutika mit antimykotischen Eigenschaften gehören zu verschiedenen Gruppen von Zytostatika. Dazu gehören Platinderivat-Antimetaboliten, DNA-Topoisomerase-Inhibitoren und Östrogenrezeptor-Modulatoren. Venetin-1, zuvor als Protein-Polysaccharid-Fraktion beschrieben, zeigte eine wirksame antimykotische Aktivität gegen C. albicans ohne Endotoxizität oder Zytotoxizität gegenüber normalen menschlichen Hautzellen54.

Zusätzlich zur Antitumoraktivität gegen nichtkleinzellige A549-Lungenkrebszellen29,55 hat die Fraktion eine zytotoxische Wirkung auf Dickdarmkrebszellen56,57. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Venetin-1 in vitro menschliche Makrophagen aktiviert und die Sekretion entzündungsfördernder Zytokine (Botenproteine) durch diese Zellen bewirkt: Interleukin 6 (IL-6) und Interleukin 1β (IL-1β). Die Erfindung wurde vom polnischen Patentamt58 patentiert. Venetin-1 kann als Bestandteil eines Präparats verwendet werden, das die Infektionsresistenz erhöht (z. B. ein immunstimulierendes Medikament) oder die Immunantwort lokal verstärkt (z. B. als Adjuvans zu bakteriellen oder viralen Impfstoffen). Da Studien gezeigt haben, dass Venetin-1 eine direkte Antitumoraktivität aufweist, legt die gezeigte immunstimulierende Wirkung die Möglichkeit nahe, Venetin-1 bei Krebspatienten einzusetzen, um die ordnungsgemäße Funktion des Immunsystems wiederherzustellen und Krebs zu bekämpfen oder eine Immunschwäche nach einer Chemotherapie zu ergänzen.

Die Suche nach einem aktiven Faktor mit antimikrobieller und antitumoraler Aktivität im Regenwurm D. veneta wird von unserem Forschungsteam seit über 10 Jahren betrieben. Diese Untersuchungen führten im ersten Schritt zur Isolierung des symbiotischen Bakteriums Raoultella ornithinolytica aus dem Magen-Darm-Trakt dieser Art. Die extrazellulären Metaboliten dieses Bakteriums produzieren antibakterielle, antimykotische und krebshemmende Verbindungen59,60,61,62,63. Zur Isolierung des Wirkstoffs ist eine Trennung mittels chromatographischer Methoden erforderlich. Es war schwierig, eine ausreichende Menge der Testsubstanz zu erhalten, und die hohen Kosten der Trennung stellten eine weitere Einschränkung dar.

Der nächste Schritt bestand darin, den Wirkstoff aus der Zölomflüssigkeit zu isolieren. Diese Forschungsphase war erfolgreich und lieferte mit kostengünstigen Methoden eine große Menge des Wirkstoffs. Nach der Inkubation bei erhöhter Temperatur wurde eine Trennung durch Dialyse durchgeführt, um Zytotoxizität zu beseitigen. Die einzige Einschränkung besteht in diesem Fall in der Anzahl der frei einstellbaren Personen.

Die Methode zur Venetin-1-Erfassung ist kostengünstig, jederzeit schnell durchführbar und für den kommerziellen Einsatz geeignet. Derzeit haben wir die Erlaubnis der Bioethikkommission erhalten, an einem Mausmodell zu forschen, und die Dosis, die das Immunsystem des Tieres wirksam stimuliert, wird in naher Zukunft ermittelt. Das Präparat wird intraperitoneal durch Injektion verabreicht, da dies der beste Weg zu sein scheint, um einen Verlust des Präparats zu vermeiden und die wirksame Dosis aufrechtzuerhalten. Nach der Bestimmung der immunmodulierenden Eigenschaften wird Venetin-1 Tieren mit Lungenkrebs injiziert, um die hemmende Wirkung zu bestimmen.

Die durch die vorliegende Forschung bestätigte krebshemmende Wirkung aktiver Nanopartikel von D. veneta auf A549-Lungenkrebszellen könnte den Einsatz eines sicheren und wirksamen Medikaments gegen Lungenkrebs ermöglichen. Die Entwicklung eines solchen Medikaments wäre ein Durchbruch in der Therapie dieser Krankheit.

Regenwürmer vom Typ Dendrobaena veneta wurden unter Laborbedingungen in der Abteilung für Immunbiologie der Maria-Curie-Skłodowska-Universität (Lublin, Polen) gezüchtet. Die Wirbellosen wurden in mit Komposterde gefüllten 3-L-Behältern bei einer Temperatur von 20 °C in völliger Dunkelheit gehalten. Die Regenwürmer wurden mit gekochtem Gemüse und grünen Teeblättern gefüttert. Die Nahrung wurde mit Ligninzellulose angereichert, die zur Herstellung von Kokons notwendig ist.

Erwachsene Regenwürmer wurden 24 Stunden lang auf feuchtem Lignin gehalten, um den Darm zu reinigen. Anschließend wurde die Zölomflüssigkeit (CF) durch milde Elektrostimulation (4,5 V) aus Gruppen von jeweils 10 Regenwurmindividuen gesammelt. CF wurde in 0,9 % NaCl geerntet und 10 Minuten lang bei 4 °C und 2500 × g zentrifugiert, um Zölomozyten zu entfernen. Dies ergab einen zellfreien Überstand, der durch Filtration durch Millipore-Filter mit einer Porengröße von 0,22 µm sterilisiert wurde. Das zellfreie CF wurde 10 Minuten lang bei 70 °C inkubiert, um zytotoxische Eigenschaften zu beseitigen. Anschließend wurde es in einen Zellulosemembranbeutel mit einem Cut-off von 12–14 kDa überführt. Die Proben wurden 24 Stunden lang bei 4 °C in Wasser dialysiert. Nach der Dialyse wurde Venetin-1 lyophilisiert. Die Zubereitung wurde bei -20 °C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde in den lyophilisierten Proben mithilfe der Bradford-Methode (Bio-Rad, USA)64 geschätzt. Für proteomische Analysen wurde nicht erhitzte und nicht dialysierte Zölomflüssigkeit (Rohzölomflüssigkeit – DVr) verwendet.

Menschliche Bronchialepithelzellen (BEAS-2B) und Lungenadenokarzinomepithelzellen (A549-Zellen) wurden in 100-mm-Polystyrol-Gewebekulturschalen in RPMI 1640-Medium (Gibco, Invitrogen, USA) mit 8 % FBS (Gibco, Invitrogen, USA) kultiviert. und 5 % Penicillin/Streptomycin (Gibco, Invitrogen, USA) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luft. Die Zellen wurden routinemäßig durch Trypsinisierung passagiert und 72 Stunden lang bei einer anfänglichen Plattierungsdichte von 2 × 105 subkultiviert. Die BEAS-2B-Zellen wurden für die Forschung von Dr. Dorota Ścieglińska vom Maria Skłodowska-Curie Memorial Cancer Center und Institut für Onkologie (Gliwice, Polen) bereitgestellt. Die A549-Zellen stammten aus der Zellkultur der Medizinischen Universität in Lublin (Polen).

Der Methyl-Thiazol-Tetrazolium (MTT)-Assay wurde verwendet, um die Zytotoxizität von Venetin-1 gegenüber den Lungenkrebszellen BEAS-2B und A549 zu bestimmen. Zunächst wurden die Zellen in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/Well ausgesät und bei 37 °C in einem CO2-Inkubator 24 Stunden lang anhaften gelassen. Am folgenden Tag wurde das Medium durch ein frisches ersetzt, das mit verschiedenen Konzentrationen von Venetin-1 ergänzt war: 15,6, 31,3, 62,5, 125, 250 und 500 µg/ml. Jede 96-Well-Platte wurde mit Kontrollgruppen (nur Zellen) und Nullanpassungsgruppen (nur Medium) eingerichtet. Der Assay wurde dreifach durchgeführt. Nach 24, 48 und 72 Stunden wurde das Kulturmedium durch ein frisches ersetzt und die Zellen wurden mit 20 µL MTT-Arbeitslösung (Invitrogen, CA USA) (5 mg/µL) 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert . Der Überstand wurde dann entfernt und violette Formazankristalle wurden in 100 μl/Vertiefung Dimethylsulfoxid (DMSO) solubilisiert, gefolgt von einer Inkubation (1 Stunde). Die Absorption der Formazanlösung wurde bei 550 nm mit einem Plattenlesegerät Victor 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Inc. Waltham, MA USA) gemessen. Der Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: [Zelllebensfähigkeit (%) = (experimentelle Gruppen-OD – Nullanpassungsgruppen-OD)/(Kontrollgruppen-OD – Nullanpassungsgruppen-OD) × 100 %. Zellinhibitionsverhältnis (%) = 1 – Zelllebensfähigkeit (%)]. Jedes Experiment wurde dreimal wiederholt.

Zur Beurteilung der Zellapoptose wurden die A549-Zellen in einer Dichte von 2 × 105 Zellen/ml auf Mikrotiterplatten mit 6 Vertiefungen ausgesät und 24 Stunden lang gezüchtet. Als nächstes wurde das Kulturmedium durch ein frisches (Kontrollzellen) ersetzt oder die Zellen wurden 72 Stunden lang 125 µg/ml Venetin-1 ausgesetzt. Um den Prozentsatz der Zellen innerhalb der Population zu bestimmen, die aktiv Apoptose durchliefen, wurde ein eBioscience™ Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Invitrogen, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, die geernteten Zellen (~ 5 × 105 / ml) wurden in 200 µL Bindungspuffer (1x) resuspendiert und 195 µL der Zellsuspension wurden nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur mit 5 µL Annexin V-FITC gemischt. Als nächstes wurden die Zellen in 200 µL Bindungspuffer (1x) gewaschen, in 190 µL Bindungspuffer (1x) resuspendiert und mit 10 µL Propidiumiodid (PI) (20 µg/ml) gefärbt. Nach 15-minütiger Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur wurden die Zellen auf einem Guava easyCyte-Durchflusszytometer (Merck, Deutschland) analysiert. Die Zellen wurden mit der InCyte™-Software von Merck Millipore analysiert. Für jede Probe wurden 10.000 Ereignisse analysiert und die Ergebnisse als Prozentsatz der Zellen in jeder Kategorie ausgedrückt. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Das Fortschreiten des Zellzyklus wurde mithilfe von PI bestimmt. Die A549-Zellen wurden wie oben beschrieben zur Beurteilung der Zellapoptose präpariert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen geerntet, mit PBS gewaschen und nach Zentrifugation (300 g, 6 Minuten, 4 °C) über Nacht mit eiskaltem 70 % Ethanol bei 4 °C fixiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, auf ~ 1 × 106 Zellen eingestellt und mit FxCycle™ PI/RNase-Färbelösung (Thermo Fisher, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt (15–30 Minuten bei 37 °C). . Die Proben wurden auf einem Guava easyCyte-Durchflusszytometer (Merck, Deutschland) analysiert. Pro Probe wurden 10.000 Ereignisse innerhalb dieses Gates erfasst.

Die Studie umfasste Kulturen normaler BEAS-2B-Zellen und A549-Lungenkrebszellen. Die Kulturen wurden unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO2 und 90 % Luftfeuchtigkeit) sowohl ohne als auch mit Zusatz von Venetin-1 durchgeführt. Zur Bestimmung der Caspasenkonzentration wurden humane CASP-ELISA-Kits verwendet (FineTest, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd., China). Die Caspase-Konzentration wurde mittels ELISA gemäß der Anleitung des Herstellers bestimmt. Die Absorptionswerte wurden bei 450 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (BioRad, USA) abgelesen.

Die A549-Krebszellen, sowohl Kontrollzellen als auch 72 Stunden lang mit Venetin-1 inkubiert (in Konzentrationen von 62,5 und 125 µg/ml), wurden mit einem Zeiss Axiovert 40CFL-Mikroskop (Carl Zeiss, Deutschland) abgebildet. Veränderungen in ihrer Struktur wurden auch mit der DIC-Funktion (Differential Interference Contrast) dokumentiert. Die Morphologie der Zellen wurde bei 60-facher Vergrößerung unter Verwendung eines Olympus BX61-Mikroskops (Olympus Corporation, Japan) sichtbar gemacht.

Veränderungen in der Morphologie der A549-Tumorzellen, die für Apoptose charakteristisch sind, wurden mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung einer Mischung aus Hoechst 33342 Fluorochrom und PI (Sigma, Deutschland) beurteilt. Die Kontrollzellen und die mit Venetin-1 behandelten Zellen wurden mit einem Zeiss LSM 5 Pascal-Mikroskop (Carl Zeiss, Deutschland) bei Emissionswellenlängen von ~ 460 nm bzw. > 575 nm abgebildet. Die Färbemischung wurde in einer Konzentration von 2,5 μl/ml zur Zellkultur gegeben und die Präparate wurden 5 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Apoptose wurde durch die leuchtend blaue Fluoreszenz der Kerne intakter oder fragmentierter Zellen nachgewiesen; Zellen mit rosa Kernen wurden als nekrotisch identifiziert.

Nach der Inkubation mit Venetin-1 wurden die nicht-kleinen Lungenkarzinom-A549-Zellen mittels REM beobachtet. Zunächst wurden sie mit 4 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,0 fixiert. Anschließend wurden die Zellen auf Objektträger montiert und 1 Stunde lang mit einer 1 %igen OsO4-Lösung gefärbt, gefolgt von der Dehydrierung in einer Reihe von Acetonlösungen (15 %, 30 %, 50 %, 70 %, 100 %). Die Präparate wurden 24 Stunden lang in einem Exsikkator mit Kieselgel getrocknet und mit einem K550X-Beschichter (Quorum Technologies, Vereinigtes Königreich) vergoldet. Die fixierten Zellen wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop Tescan Vega 3 (Tescan, Tschechische Republik) analysiert.

Die Struktur von Venetin-1 wurde mit einem Quanta 3D FEG Rasterelektronenmikroskop (FEI, Japan) beobachtet und dokumentiert. Für mikroskopische Beobachtungen wurde ein lyophilisiertes Präparat verwendet, das keiner standardmäßigen Dehydratisierung und Goldsputtern unterzogen wurde. Dieses Verfahren ermöglichte die Visualisierung des Wirkstoffs in seiner natürlichen Form.

Die Oberfläche der Kontrollkrebszellen und der mit Venetin-1 behandelten Zellen wurde mittels AFM analysiert. Die Messungen wurden mit einem NanoScope V AFM-Mikroskop durchgeführt, das im PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping-Modus mit MultiMode 8 (Bruker, Veeco Instruments Inc.) betrieben wurde. Es war mit der NanoScope 8.15-Software ausgestattet. Der lokale Elastizitätsmodul wurde mithilfe des Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)-Moduls bestimmt. Die nominelle Federrate der RTESPA-Sonde (Bruker, USA) (Silikonspitze auf einem Nitridhebel) betrug 40 N/m. Der Elastizitätsmodul wurde für einen ausgewählten Bereich der A549-Zelloberfläche bestimmt. Die Proben wurden wie für SEM beschrieben vorbereitet. Der Elastizitätsmodul wurde für 20 Felder in jeder Probe bestimmt (dunkle Bereiche mit geringer Steifigkeit und helle Bereiche mit hoher Steifigkeit). Die Daten wurden statistisch ausgewertet.

Die Trennung von Proteinen aus Venetin-1 und roher Zölomflüssigkeit (DVr) wurde mit der Entwicklung des automatischen SageElf-Systems (Sage Science, Beverly, MA, USA) in einer 3 % SDS-Agarose-Gelkassette (ELP3010) durchgeführt. Es ermöglicht die Trennung von Proteinen im Bereich von 10–300 kDa. Alle notwendigen Lösungen (Ladepuffer) und der Marker wurden mit den Kassetten im Set mitgeliefert. Die Probe wurde in einer Beladungslösung gelöst, um eine Konzentration von 200 mg Protein in 26 ml zu erhalten. Anschließend wurden der Probe 4 ml 0,5 M DTT zugesetzt und die gesamte Mischung 6 Minuten lang auf 85 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden 10 ml der Beladungslösung mit dem fluoreszierenden Marker-03 zur Probe gegeben und die Probe gemischt. Die so hergestellten Proteine ​​wurden in eine 3 % SDS-Agarose-Kassette eingebracht. Die Trennung (größenbasierter Modus) bestand in der automatischen Elution von Proteinen aus dem Gel für 1 Stunde 20 Minuten und dann 30 Minuten. Das System wurde von der SageElf-Softwareversion 1.08 gesteuert. Es ergaben sich 12 Fraktionen des Präparats, die dann mit einem Standard-FASP-Verfahren und Trypsin (Trypsin Gold, Promega) verdaut wurden27,65. Die aus zwei Läufen erhaltenen Fraktionen wurden für ein FASP-Verfahren kombiniert. Die Endreinigung erfolgte gemäß dem Stage Tips-Verfahren66.

Die Spektrumregistrierung wurde mit einem Massenspektrometer TripleTOF 5600+ (Sciex Framingham, MA, USA) durchgeführt, das an ein Chromatographiesystem, das Ekspert MicroLC 200 Plus System (Eksigent, Redwood City, CA, USA), angeschlossen war. Alle chromatographischen Trennungen wurden auf der ChromXP C18CL-Säule (3 µm, 120 Å, 150 × 0,3 mm) durchgeführt. Für jede Probe betrug der chromatographische Gradient für jeden MS-Lauf 11–42,5 % B (Lösungsmittel A: 0 % wässrige Lösung, 0,1 % Ameisensäure; Lösungsmittel B: 100 % Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure) für 60 Minuten. Das gesamte System wurde von der Software SCIEX Analyst TF 1.7.1 gesteuert. Messungen für die Spektralbibliothek wurden im datenabhängigen Erfassungsmodus (DDA) erfasst. Jeder Zyklus der angewandten DDA-Methode umfasste die Akkumulation der Vorläuferspektren in 100 ms im Bereich von 400–1200 m/z, gefolgt von der Akkumulation der Produkt-Ionen-Spektren der 20 besten Vorläufer in 50 ms im Bereich von 100–1800 m/z in einer Gesamtzykluszeit von 1,15 s. Ehemals fragmentierte Vorläuferionen wurden dynamisch ausgeschlossen.

Für die Datenbanksuche wurde die Software PeaksStudio XPRO (Bioinfor, Kanada) verwendet. Die Proteinidentifizierung erfolgte auf Basis der überprüften Annelida-Datenbank (05.04.2022, Uniprot) mit den folgenden Parametern: Filterladung 2–8, Fehlertoleranz für Vorläufermasse – 25 ppm, Fragmentionentoleranz 0,5, maximale fehlende Spaltungen pro Peptid – drei feste Modifikationen – Carbamidomethylierung, variabel – Met-Oxidation, 1 % FDR für Peptide und Proteine. Die endgültigen Analysen wurden basierend auf dem Ergebnis der Spider-Datei durchgeführt. Die erhaltenen Daten wurden im Pride-Repository67 unter der Kennung abgelegt.

Für die SPR-Experimente wurden 3 mM molare Liposomen-Stammlösungen aus Sphingomyelin (SM) und 1-Palmitoyl-2-deoylphpsphatydilcholin (POPC) hergestellt. Die Liposomenlösung wurde wie zuvor beschrieben68 hergestellt. Kurz gesagt, lyophilisiertes POPC-Pulver (Avanti Polar Lipids, USA) und Sphingomyelin (Hühnerei; Avanti Polar Lipids, USA) wurden in PBS-Puffer (Sigma Aldrich, USA) suspendiert. Die Phospholipidsuspension wurde 10 Inkubationszyklen unterzogen, die eine 30-minütige Inkubation in einem Ultraschallbad mit Erhitzen (333 K) und eine 30-minütige Inkubation bei 277 K umfassten. Anschließend wurde die Extrusion mit einem Avanti Mini Extruder (Avanti Polar Lipids, USA) durchgeführt. mit einer 0,1 µm Porenmembran. Dieser Vorgang, dh das Leiten der Lipidlösung durch den Extruder, wurde elfmal wiederholt. Nach Abschluss des Extrusionsvorgangs war die Probe gebrauchsfertig.

Die Bindung der Lipide Sphingomyelin (SM) und 1-Palmitoyl-2-deoylphpsphatydilcholin (POPC) wurde am L1-Sensor (Cytiva, USA) unter Verwendung des Biacore T200-Instruments (Cytiva, USA) durchgeführt. Die Interaktion der Proteine ​​wurde nach der Immobilisierung der Lipide (SM oder POPC) auf der Oberfläche des L1-Sensorchips wie im Handbuch des Herstellers beschrieben analysiert. SM wurde auf das Reaktionsniveau von 3659,96 RU (± 415,45 RU) immobilisiert und POPC wurde auf das Reaktionsniveau von 4995,67 RU (± 570,47 RU) immobilisiert. Anschließend wurde der Sensor mit einer 0,5-mg/ml-Albuminlösung blockiert und das Standardprotokoll des Herstellers „Injection and Recovery“ angewendet. Die Proteinextrakte wurden über die Oberfläche des Sensorchips laufen gelassen, wobei immobilisierte Lipide die Proteinbindung ermöglichten. Als nächstes wurden nach 30-sekündiger Inkubation mit 0,5 % TFA die gebundenen Proteine ​​in 50 µl 50 mM NH4HCO3 gewonnen. Anschließend wurden die aus mindestens zwei Durchflusszellen entnommenen Proben mittels MS analysiert. Nach allen Analysen wurde das Hintergrund-Referenz-Antwortspektrum vom experimentellen Antwortspektrum abgezogen und die Ergebnisse in Sensorgrammen dargestellt.

Aus dem SPR-Experiment gesammelte Fraktionen, die an die getesteten Lipide gebundene Proteine ​​enthielten, wurden einem klassischen Aufschluss in einer Lösung unterzogen. Vor der Trypsin-Zugabe wurden die Proben mit einer 50 mM DTT-Lösung (45 Min., 56 °C) und anschließend mit IAA (45 Min. im Dunkeln) behandelt. Der Trypsinverdau wurde über Nacht bei 37 °C durchgeführt. Als der Aufschluss durch Senken des pH-Werts der Lösung (1 % Ameisensäure in Wasser) gestoppt wurde, wurden die Proben mit StageTips gereinigt und auf 30 ml konzentriert. Die LC-MS/MS-Analyse und Proteinidentifizierung erfolgte analog wie bei den Venetin-1-Proben.

Die Venetin-1-Lösung mit einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml wurde 10 Minuten lang bei 40 °C in eine Ultraschallkammer (Pol-Sonic, Polen) gegeben. Anschließend wurde die wässrige Suspension auf einem TEM-Netz mit gestanzter Kohlenstofffolie (Quantifoil R 2/2; Quantifoil Micro Tools GmbH, Großlöbichau, Deutschland) verglast. Das Netz wurde zuvor mit einem Femto-Gerät (Diener Electronic, Ebhausen, Deutschland) für 15 s in Sauerstoffplasma aktiviert. Eine 3-µL-Probe wurde auf das Netz aufgetragen. Anschließend wurde ein Blotting mit Filterpapier und ein sofortiges Einfrieren in flüssigem Ethan unter Verwendung eines Vitrobot Mark IV-Gebläses (FEI Company, Hillsboro, Oregon, USA) durchgeführt. Glasierte Proben wurden in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis sie in einen Cryo-TEM Gatan 626-Halter (Gatan Inc., Pleasanton, USA) gegeben wurden. Bilder der kryogenen Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) wurden mit einem Tecnai F20 Zur Bildaufzeichnung wurde eine Eagle 4 k HS-Kamera (FEI Company, USA) und zur Verarbeitung TIA-Software (FEI Company, USA) verwendet.

Die chemischen Untersuchungen von Venetin-1 wurden mit der XPS-Elektronenspektroskopie-Methode durchgeführt. Die Analysen wurden im Mehrkammer-Analysesystem Prevac UHV (Prevac, Polen) durchgeführt. Nach der Montage auf dem Molybdänträger wurden die getesteten Venetin 1-Proben bei Raumtemperatur auf ein konstantes Hochvakuum von ~ 5 × 10–8 mbar in der Ladeschleuse des UHV-Systems entgast. Die XPS-Analyse wurde durchgeführt, nachdem die Probe in die Analysekammer des UHV-Systems eingeführt wurde. Als Photoelektronen-Anregungsquelle diente eine monochromatische AlKα-Strahlungsquelle. Die Photoelektronen wurden durch Röntgenstrahlung mit einer charakteristischen Linie AlKα und einer Energie von 1486,7 eV angeregt, die von einer VG Scienta SAX 100-Lampe mit einer Aluminiumanode zusammen mit einem VG Scienta XM 780-Monochromator erzeugt wurde.

Übersichtsspektren wurden in einem weiten Bereich von Bindungsenergien unter Verwendung der folgenden Analysatorparameter durchgeführt: Betriebsmodus – Sweeping, 200 eV Übergangsenergie, gemessener Bereich der Photoelektronenbindungsenergie 0–1200 eV, Messschritt von 0,5 eV, Sammelzeit in einem einzigen Schritt – 0,2 s, Anzahl der Iterationen – 4.

Nach der Erstellung des Untersuchungsspektrums wurden auch Spektren in einem engen Bereich von Bindungsenergien für Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel erstellt. Die Tests wurden mit den folgenden Analysatorparametern durchgeführt: Betriebsmodus – Sweeping, 50 eV Übergangsenergie, Messschritt – 0,1 eV, Sammelzeit in einem einzelnen Schritt – 0,667 s.

Für quantitative Berechnungen wurden die erhaltenen Spektren mit der Casa XPS-Software verarbeitet. Die der Bindungsenergie entsprechenden X-Achsen wurden unter Verwendung des aliphatischen C1s-Kohlenstoffpeaks kalibriert. Die diesem Peak entsprechende Bindungsenergie wurde mit EB = 285,0 eV angenommen.

Um die Größe der Venetin-1-Mikropartikel zu charakterisieren, führten wir ein DLS-Experiment mit dem Instrument Prometheus Panta (NanoTemper Technologies GmbH, Deutschland) durch. Die Proben wurden in acht Kapillaren geladen, die als Replikate dienten, wo die parallele Analyse die Homogenität der Mikropartikel offenbarte.

Daten aus proteomischen Analysen wurden im PRIDE-Repository hinterlegt und sind unter der Zugangsnummer PXD034132 verfügbar.

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Die chemische Analyse des Wirkstoffs wurde durch das Projekt des Nationalen Wissenschaftszentrums Polen [2020/37/B/NZ7/00763] unterstützt. Wir möchten Dr. Dorota Ścieglińska vom Maria Skłodowska-Curie Memorial Cancer Center und Institut für Onkologie (Gliwice, Polen) für die Bereitstellung der BEAS-2B-Zellen danken.

Interkollegiale Fakultät für Biotechnologie der Universität Danzig und der Medizinischen Universität Danzig, Danzig, Polen

Magda Rybicka, Paulina Czaplewska, Katarzyna Węgrzyn, Agata Szpiech & Natalia Musiał

Abteilung für Biologie und Genetik, Medizinische Universität Lublin, Lublin, Polen

Jolanta Rzymowska

Analytisches Labor, Institut für Chemische Wissenschaften, Fakultät für Chemie, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, Lublin, Polen

Weronika Sofińska-Chmiel

Abteilung für Immunbiologie, Institut für Biowissenschaften, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, Lublin, Polen

Sylwia Wójcik-Mieszawska & Marta J. Fiołka

Abteilung für Zellbiologie, Institut für Biowissenschaften, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, Lublin, Polen

Kinga Lewtak

Fakultät für Chemie, Universität Danzig, Danzig, Polen

Przemyslaw Jurczak

Malopolska Center of Biotechnology, Jagiellonen-Universität, Krakau, Polen

Jakub Nowak

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MF erhielt den aktiven Komplex von Venetin-1, führte Kryo-TEM- und SEM-Analysen, AFM-Präparate, Apoptoseanalysen (Abb. 5) durch, koordinierte die Forschung und verfasste den Hauptmanuskripttext; SWM verfasste eine Einleitung und erstellte die Abbildungen 7 und 4 sowie eine statistische Analyse. JR führte eine Caspase-Analyse und eine optische Mikroskopie von Krebszellen durch (Abb. 55 a); KL hat Abb. 4 und Abb. 6 sowie Literatur angefertigt; MR-durchflusszytometrische Analyse; PC-Analyse der Ergebnisse, Vorbereitung der SPR-Messungen, Erstellung des Manuskripts; KW führte SPR-Messungen und die Zusammenstellung von SPR-Daten durch; PJ bereitete Liposomen vor; AS und NM führten die SageElf-Trennung, den FASP-Verdau, die Vorbereitung und Analyse der LC-MS/MS-Methode durch, WSC führte die XPS-Analyse durch und JN führte die Pantha-Analyse durch.

Korrespondenz mit Paulina Czaplewska oder Marta J. Fiołka.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Rybicka, M., Czaplewska, P., Rzymowska, J. et al. Neuartiges Venetin-1-Nanopartikel aus der Zölomflüssigkeit von Regenwürmern als vielversprechendes Mittel zur Behandlung von nichtkleinzelligem Lungenkrebs. Sci Rep 12, 18497 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21665-8

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Eingegangen: 17. Mai 2022

Angenommen: 29. September 2022

Veröffentlicht: 02. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21665-8

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Wissenschaftliche Berichte (2023)

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