Verbesserung eines synthetischen Lebendbakterientherapeutikums gegen Phenylketonurie mit Biosensor

Nature Communications Band 12, Artikelnummer: 6215 (2021) Diesen Artikel zitieren

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Bei Patienten mit Phenylketonurie (PKU) führt ein genetischer Defekt im Enzym Phenylalaninhydroxylase (PAH) zu einem erhöhten systemischen Phenylalanin (Phe), was zu schweren neurologischen Beeinträchtigungen führen kann. Zur Behandlung von PKU wurde der Escherichia coli Nissle (EcN)-Stamm SYNB1618 im Rahmen der Synthetic Biotic™-Plattform von Synlogic entwickelt, um Phe im Magen-Darm-Trakt abzubauen. Dieser im klinischen Stadium entwickelte Stamm exprimiert das Phe-metabolisierende Enzym Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL), das die Desaminierung von Phe zum ungiftigen Produkt Transcinnamat (TCA) katalysiert. In der vorliegenden Arbeit erzeugen wir einen wirksameren EcN-basierten PKU-Stamm durch Optimierung der PAL-Aktivität ganzer Zellen mithilfe eines biosensorbasierten Hochdurchsatz-Screenings mutierter PAL-Bibliotheken. Ein führender Enzymkandidat aus diesem Screening wird bei der Konstruktion von SYNB1934 verwendet, einem chromosomal integrierten Stamm, der die zusätzlichen Phe-metabolisierenden und biologischen Sicherheitsmerkmale von SYNB1618 enthält. Im Vergleich zu SYNB1618 zeigt SYNB1934 einen ungefähr zweifachen Anstieg der In-vivo-PAL-Aktivität.

Die Stoffwechselerkrankung Phenylketonurie (PKU) ist durch das Fehlen oder die gestörte Funktion des Enzyms Phenylalaninhydroxylase (PAH) gekennzeichnet. Patienten mit PKU sind nicht in der Lage, die Aminosäure Phenylalanin (Phe) zu verstoffwechseln, was zu einer systemischen Akkumulation führt. Erhöhte Phe-Werte können unbehandelt zu schweren neurologischen Komplikationen und Behinderungen führen. Glücklicherweise wird PKU seit über 50 Jahren durch Neugeborenen-Screening diagnostiziert, und wenn die Krankheit innerhalb der ersten Lebenswochen erkannt und behandelt wird, können schwere Behinderungen gemildert werden1.

Da Phe eine essentielle Aminosäure ist, kann ihre Aufnahme bei Patienten durch eine Einschränkung der Proteinzufuhr in der Nahrung kontrolliert werden; Allerdings gelingt es vielen Patienten aufgrund der strengen Natur der Diät nicht, eine dauerhafte Compliance zu erreichen. Tatsächlich wurde das Absetzen der PKU-Diät im Erwachsenenalter mit einer deutlichen Einschränkung der exekutiven Funktion und einer schweren depressiven Störung in Verbindung gebracht2,3. Zusätzlich zur Kontrolle der Phe-Aufnahme durch diätetisches Management gibt es zwei zugelassene pharmakologische Behandlungsmöglichkeiten. Eine dieser Optionen, Sapropterindihydrochlorid (KUVAN, BioMarin Pharmaceutical), ist ein PAH-Aktivator für Patienten mit Tetrathydrobiopterin (BH4)-responsiver PKU. Sapropterin ist ein BH4-Analogon, das zusätzlichen Cofaktor bereitstellt und/oder die produktive Faltung des mutierten PAH-Enzyms fördert. Aufgrund seines Mechanismus ist Sapropterin jedoch nur bei der Untergruppe der PKU-Patienten wirksam, die über eine restliche PAH-Aktivität verfügen, die schätzungsweise etwa ein Drittel der PKU-Population ausmacht4,5. Selbst bei Patienten, die auf BH4 ansprechen, wird Sapropterin selten als alleinige Therapie eingesetzt und sollte mit einer parallelen Ernährungstherapie kombiniert werden6. Die andere Behandlungsoption, Pegvaliase (Palynziq, BioMarin Pharmaceutical), besteht aus einem systemisch injizierten pegylierten Phe-abbauenden Enzym, der Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL). Diese Therapie wurde jedoch mit Berichten über schwere immunvermittelte Nebenwirkungen und Anaphylaxie in Verbindung gebracht7,8. Es besteht weiterhin Bedarf an sicheren, oral verabreichten therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten für PKU-Patienten, die den Bedürfnissen der gesamten Patientenpopulation gerecht werden, unabhängig von Alter oder genetischem Hintergrund.

In jüngster Zeit besteht großes Interesse an der Anwendung der synthetischen Biologie zur Entwicklung und Entwicklung probiotischer Organismen, die therapeutische Funktionen im Magen-Darm-Trakt (GI) ausüben können9. Wir haben bereits über die Konstruktion und Charakterisierung des lebenden biotherapeutischen Produkts (LBP) SYNB1618 zur Behandlung von PKU10 berichtet. Dieser genetisch veränderte Stamm von Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) exprimiert Enzyme, darunter PAL (StlA) aus Photorhabdus luminescens und L-Aminosäure-Deaminase (LAAD) aus Proteus mirabilis11, die dazu bestimmt sind, in der Nahrung aufgenommenes und enterorzirkulierendes Phe in ungiftige Metaboliten abzubauen Magen-Darm-Trakt (Zimtsäure12,13 bzw. Phenylpyruvat14). Es wurde berichtet, dass SYNB1618 den Plasma-Phe bei Pahenu2/enu2-Mäusen (einem PKU-Mausmodell) deutlich senkt und einen Anstieg des Plasma-Phe bei gesunden nichtmenschlichen Primaten (NHPs), denen ein Proteinbolus verabreicht wurde, deutlich verhindert10. SYNB1618 wurde in einer randomisierten, placebokontrollierten First-in-Human-Studie an gesunden Probanden und PKU-Patienten untersucht. Dabei erwies sich der Stamm als sicher und gut verträglich, mit einem dosisabhängigen Anstieg der SYNB1618-spezifischen Phe-Metaboliten im Plasma und Urin15.

Mit zunehmender Begeisterung für technische LBPs steigt auch das Interesse an Methoden zur Verbesserung ihrer Leistung. Für Organismen wie E. coli gibt es eine Vielzahl modularer Teile für den Aufbau transkriptioneller Genschaltkreise, die die einstellbare Expression der manipulierten Effektorfunktion ermöglichen9. Die Verbesserung der heterologen Genexpression in gentechnisch veränderten Stämmen ist ein unkomplizierter Ansatz zur Optimierung der Aktivität und der erste potenzielle Engpass, der bei der Maximierung der Stammfunktion angegangen werden muss. Die Verbesserung der Stammfunktion über die Genexpression hinaus beruht auf der Anwendung anderer bestehender oder sich entwickelnder Technologien.

Biosensoren haben sich als vielversprechender Ansatz zur Beseitigung von Durchsatzbeschränkungen im Stoffwechsel- und Protein-Engineering erwiesen16. Bei der Steuerung eines Reportersignals wie Wachstum oder Fluoreszenz ermöglichen Biosensoren die schnelle Anreicherung von Bibliotheksgrößen, die bisher nicht zugänglich waren. Die Screening-Raten können 107 pro Stunde erreichen, wenn Fluoreszenz als Reporter verwendet wird und die Zellen auf einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) phänotypisiert werden17. Bisher konzentrierten sich Biosensor-Screening-Bemühungen auf den Einsatz allosterischer Transkriptionsfaktoren (aTFs), die in der Natur vorkommen, um die Produktion so unterschiedlicher Metaboliten wie des Flavonoid-Antioxidans Naringenin bis zum seltenen ungiftigen Zucker Psicose zu verbessern18,19,20,21,22,23 . Obwohl aTFs erfolgreich entwickelt wurden, um auf neuartige Metaboliten zu reagieren24,25,26, gibt es unseres Wissens keine veröffentlichten Berichte, die die Verwendung von manipulierten aTFs zur Verbesserung kommerzieller oder therapeutischer Stämme beschreiben.

In dieser Arbeit haben wir zunächst einen aTF entwickelt, um das Vorhandensein von Transcinnamat (TCA), dem Produkt des Phe-Katabolismus durch PAL, zu erkennen und darauf zu reagieren. Mithilfe dieses Biosensors als Mittel sowohl zum Screening als auch zur Selektion beschreiben wir die gerichtete Entwicklung von StlA, dem PAL in unserem LBP, für eine verbesserte Gesamtzellaktivität. Wichtig ist, dass Screening und Selektion in EcN durchgeführt werden konnten, sodass die Verstärkung der PAL-Aktivität im Kontext eines therapeutisch relevanten Stamms bewertet werden konnte. Eine mögliche PAL-Variante wurde verwendet, um einen therapeutischen PKU-Stamm der zweiten Generation, SYNB1934, zu konstruieren, der nachweislich SYNB1618 in vitro und in vivo übertrifft.

PAL ist ein relativ unkompliziertes Enzym, das nicht auf Sauerstoff, Redoxäquivalente oder Cofaktoren angewiesen ist27. Im Gesamtzellkontext kann die PAL-Aktivität jedoch durch eine Vielzahl physiologischer oder umweltbedingter Faktoren beeinflusst werden, darunter die bakterielle Stoffwechselaktivität (um Phe in oder TCA aus den Zellen herauszutreiben), den externen pH-Wert oder die Hemmung des Endprodukts. In Vorarbeiten sollte ermittelt werden, ob die Stammaktivität durch die PAL-Expression geschwindigkeitsbegrenzt wird, da dies einen einfachen Weg zur Stammoptimierung bieten würde. Die TCA-Produktion erreichte jedoch mit zunehmender PAL-Expression ein Plateau (ergänzende Abbildung 1). Wir konzentrierten uns daher auf die Optimierung der Leistung und nicht auf die Expression des PAL-Enzyms selbst im Ganzzellformat.

Um das Screening hochkomplexer PAL-Bibliotheken auf einen verbesserten Phe-Abbau (TCA-Produktion) zu ermöglichen, wurde ein spezifischer TCA-responsiver Biosensor mithilfe der proprietären Sensor-Engineering-Plattform von Zymergen entwickelt. In Abwesenheit von TCA unterdrückt das manipulierte aTF die Expression eines Gens (in Abb. 1a mit gfp gekennzeichnet), das für das fluoreszierende Reporterprotein (grün fluoreszierendes Protein, GFP) kodiert; Wenn TCA in das System eingeführt wird, wird die Unterdrückung gelindert und GFP wird exprimiert (Abb. 1a). Dieses Sensorsystem wurde als High-Copy-Plasmid in einen Wildtyp-EcN-Hintergrund transformiert und zeigte eine nach Rang geordnete GFP-Signalauslesung für TCA, die durch eine Leiter von PAL-Varianten aus frühen technischen Bemühungen erzeugt wurde und aus Low-Copy-Konstrukten exprimiert wurde (Abb . 1b). Zu Demonstrationszwecken wurde jeder der Stämme in Abb. 1b separat in Reagenzgläsern kultiviert und bei Sättigung auf einem Durchflusszytometer auf das GFP-Signal pro Zelle analysiert. Dieser Strain-Ladder-Ansatz berücksichtigt keinen Stamm-Crosstalk, der in einer gepoolten Bibliothek beobachtet werden könnte (z. B. Produzenten mit niedrigem TCA-Gehalt, die auf TCA in den Massenmedien reagieren, die durch verbesserte Produktionsphänotypen erzeugt werden). Eine signifikante Anreicherung einer hochkomplexen gepoolten Bibliothek, die weiter unten ausführlicher beschrieben wird, wurde mithilfe eines mikrofluidischen Arbeitsablaufs erreicht (Abb. 1c; Mock vs. Top 1 % p < 0,0001, Mock-Mock vs. Top 1 % – Top 1). % p < 0,0001 und zusätzliche Anreicherung von den oberen 1 % zu den oberen 1 % bis zu den oberen 1 % p < 0,0001, Welch-Varianzanalysetest (ANOVA) mit Dunnetts T3-Mehrfachvergleichstest).

a Schematische Darstellung der biosensorgesteuerten Reporterexpression. In Abwesenheit von TCA bindet der allosterische Transkriptionsfaktor (aTF, in der Abbildung mit Sensor gekennzeichnet) die DNA-Operatorstelle und verhindert die Expression des Reportergens gfp, das für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert. PAL-Aktivität wandelt l-Phe in TCA um; TCA bindet an das Sensor-aTF und verursacht eine Konformationsänderung, um die DNA-Bindung (Repression) zu verringern und die Expression des Reportergens zu ermöglichen. Symbole und Abkürzungen: Phenylalanin (l-Phe, gelb ausgefüllte Kreise), Transzimtsäure (TCA, orangefarbene leere Kreise), PAL (Phenylalanin-Ammoniak-Lyase). b Oben: Gesamtzellaktivität (siehe Methoden, plattenbasiert) von sechs StlA-PAL-Varianten, normalisiert auf Wildtyp-StlA-Aktivität (Fold-over-Wildtyp-, FOWT- und Wildtyp-Werte finden Sie in den Quelldaten). . n = 2 biologische Replikate, einzelne Datenpunkte dargestellt. Unten: GFP-Histogramme pro Zelle von Varianten aus dem oberen Feld nach dem Wachstum bis zur Sättigung mit gleichzeitiger Expression der stlA-Variante (Gen, das für StlA kodiert), Sensorreaktion und gfp-Expression (Gen, das für GFP kodiert). Die Farben sind zwischen den Diagrammen konsistent. n = 1 repräsentative Kultur pro Stamm mit 50.000 analysierten Zellen. c Anreicherungsdemonstration der entworfenen PAL-Bibliothek. Boxplots, die die FOWT-Aktivität verschiedener Sortenpopulationen mit begleitenden klonalen Datenpunkten zeigen. Die Kästchen erstrecken sich vom ersten bis zum dritten Quartil, wobei eine Mittellinie den Median angibt. Die oberen und unteren Whisker erstrecken sich bis zum Maximal- bzw. Minimalpunkt innerhalb des 1,5-fachen Interquartilbereichs der Boxgrenzen. Datenpunkte außerhalb der Whisker gelten als Ausreißer. Sortier-/Kontrollbeschreibungen: Wildtyp, EcN mit Wildtyp-StlA, n = 12 biologische Replikate, normalisiert auf den Durchschnitt der 12 Wildtyp-Produktionswerte; Schein, Bibliothek sortiert nach Zellgröße und Dublett-Ausschluss ohne GFP-basiertes Gating, n = 90 unabhängige Kolonien aus dem sortierten Pool; Top 1 %, Auswahl der obersten 1 % der hellsten Zellen, ebenfalls basierend auf Zellgröße und Dublett-Ausschluss, n = 90 unabhängige Kolonien aus dem sortierten Pool; Mock-Mock, Scheinpopulation mit Sensor in frischen EcN-Hintergrund retransformiert und ein zweites Mal ohne GFP-Selektion scheinsortiert, n = 90 unabhängige Kolonien aus dem sortierten Pool; Top 1 % – Top 1 %, Top 1 % Population mit Sensor in frischen EcN-Hintergrund retransformiert und nach den obersten 1 % der hellsten Zellen sortiert, n = 90 unabhängige Kolonien aus dem sortierten Pool. Die P-Werte wurden mithilfe des ANOVA-Tests von Welch und des T3-Mehrfachvergleichstests von Dunnett berechnet.

Crosstalk ist ein häufiges Problem beim Einsatz von Selektionstechnologien zur Isolierung verbesserter Produktionsphänotypen für Metaboliten, die durch die Zellmembran diffundieren oder transportiert werden, einschließlich TCA. Durch Verdünnung der Kulturen und Verkürzung der Kultivierungsdauer, um die Ansammlung von TCA im Hauptmedium zu minimieren, konnten Flachbart et al.18 mithilfe eines darauf basierenden Sensorsystems Enzymvarianten mit verbesserter PAL-Aktivität aus einer fehleranfälligen Bibliothek mit 2,3 × 106 Mitgliedern isolieren nativer TCA-responsiver Aktivator HcaR aus E. coli. Ein weiterer Ansatz zur Minimierung der Diffusion kleiner Moleküle besteht darin, einzelne Varianten mikrofluidisch in fluoriertem Öl oder in Gelkügelchen einzukapseln19,28,29 und anschließend die Tröpfchen zu sortieren30, was jedoch zu Lasten des Durchsatzes geht. Während die Erzeugung von Wasser-in-Öl-Tröpfchen Frequenzen von bis zu 10.000 Tröpfchen pro Sekunde erreichen kann30, erreichen Technologien zur Sortierung von Wasser-in-Öl-Tröpfchen im Allgemeinen zuverlässig Raten von nur zehn bis Hunderten von Tröpfchen pro Sekunde19,30. Dies kann auf etwa tausend Tröpfchen pro Sekunde erhöht werden, indem die Wasser-in-Öl-Tröpfchen in einer zweiten wässrigen Phase (d. h. Wasser-in-Öl-in-Wasser-Tröpfchen, auch Doppelemulsionen genannt) eingekapselt und auf einem kommerziell erhältlichen FACS28 sortiert werden , aber das Doppelemulsionsverfahren ist technisch anspruchsvoll und anfällig für Instabilität und Absetzen beim Sortieren.

In der vorliegenden Arbeit kombinieren wir die Diffusionsminderung von Tröpfcheninkubationen mit dem Durchsatz und der einfachen Zellsortierung auf einem FACS in einem Arbeitsablauf, den wir Pop 'n' Sort (Abb. 2)31 genannt haben und der durch den Genotyp ermöglicht wird. Phänotyp-Assoziation unserer Sensortechnologie. Da die PAL-Varianten innerhalb desselben EcN-Stamms exprimiert wurden, der das Sensorsystem beherbergt, ist die GFP-Reaktion mit der Produzentenzelle selbst verknüpft und nicht mit dem Tröpfchen, wie es bei kokultivierten Systemen aus Produzenten und dedizierten Sensorzellen der Fall ist19,29. Signifikante Anreicherungen wurden bei Verwendung der Pop-and-Sort-Methode (ergänzende Abbildung 2b; Mock-Mock vs. Top 1 % – Top 1 % p = 0,0007, Welchs ANOVA-Test mit Dunnetts T3-Mehrfachvergleichstest) im Vergleich zur direkten Sortierung aus der Sättigung erzielt Flüssigkultur (Ergänzende Abbildung 2a; p = 0,1408).

EcN-Zellen, die das High-Copy-Sensorsystem-Plasmid (manipulierte aTF-Expression, mit aTF-reprimiertem gfp-Gen, das für das grün fluoreszierende Protein GFP kodiert) und eine Bibliothek von Low-Copy-induzierbaren stlA-Varianten-Expressionsplasmiden enthielten, wurden in einem Pool zusammengezogen; Verschiedene Zellen in diesem Pool enthalten einzigartige stlA-Sequenzen. Nach einem Vorkulturschritt in einem reichhaltigen Medium werden die Zellen gewaschen und für das Sensorscreening in einem angepassten M9-Minimalglukosemedium resuspendiert, das gleichzeitig die stlA-Expression induziert und das Substrat Phe bereitstellt. In diesem Stadium werden die Zellen auf eine OD600 verdünnt, was zu einer Zell-/Tröpfchenbeladung von ca. 1 führt. Diese verdünnten, gewaschenen Zellen im Medium dienen als wässrige Phase für die Tröpfchenerzeugung in einem fluorierten Öl mit Fluortensid. Da die Zellbeladung einer Poisson-Verteilung folgt, sind einige Tröpfchen leer und andere enthalten zum Zeitpunkt 0 mehrere Zellen/Genotypen, wie oben gezeigt. Die beladenen Tröpfchen werden bis zur Sättigung inkubiert, etwa 16 Stunden. Zu diesem Zeitpunkt gibt es viele Zellen pro Tröpfchen, und diese Zellen haben TCA und ein GFP-Signal pro Zelle produziert, das mit dieser TCA-Produktion korreliert. Da das GFP-Signal mit der Zelle selbst verbunden ist, können wir die Emulsionen mit Standardtechniken aufbrechen und die Zellen dann direkt auf einem FACS nach dem gewünschten Phänotyp sortieren. Einzelheiten zu Rezepten, Materialien und Protokollen finden Sie unter Methoden.

Bei den hier beschriebenen Pop-and-Sort-Anreicherungen wurden Zellen mikrofluidisch in Wasser-in-Öl-Tröpfchen bei etwa 1 Zelle/Tröpfchen eingekapselt. Die Tröpfchen wurden inkubiert, bis die eingekapselten Kulturen gesättigt waren, etwa 16 Stunden unter unseren Medien- und Wachstumsbedingungen. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Emulsionen aufgebrochen (Methoden). Die wässrige Schicht mit den Zellen wurde vom Öl getrennt und konnte mithilfe von Standardprotokollen direkt auf einem FACS sortiert werden. Der oben beschriebene Ultrahochdurchsatz-Screening-Ansatz ermöglichte es uns, eine mehr als 1 Million Mitglieder umfassende kombinatorische Bibliothek rechnerisch entworfener Mutationen zu screenen.

Mit RosettaCM32 (siehe Methoden) wurde ein Homologiemodell von StlA erstellt und zur Identifizierung von Resten im aktiven Zentrum verwendet. Um die StlA-Aktivität zu verbessern, wurden Positionen rund um das aktive Zentrum gezielt variiert. Um durch Mutationen im und um das aktive Zentrum verursachte Instabilitäten zu kompensieren, wurden phylogenetische (positionsspezifische Bewertungsmatrix33; PSSM) und koevolutionäre (GREMLIN34) Analysen durchgeführt, um günstige Reste vorzuschlagen (siehe Methoden). Wie in Abb. 3a gezeigt, führen die PSSM- und GREMLIN-Evolutionsanalysen stabilisierende Mutationen ein, die weit über StlA verteilt sind.

Interessante Positionen werden in einem mit RosettaCM für StlA generierten Homologiemodell hervorgehoben. Reste im aktiven Zentrum sind rot hervorgehoben. a Positionen, die während des Bibliotheksaufbaus für die kombinatorische Mutagenese vorgesehen sind. Alle in den Bibliotheksvorlagen (siehe Methoden) mutierten Positionen werden grün hervorgehoben und zusätzliche Mutationen, auf die während der kombinatorischen Mutagenese abgezielt wird, werden rosa angezeigt. b Positionen bei Top-Hits mutiert. Positionen, die in der endgültigen SYNB1934-PAL-Variante mutiert sind, sind gelb hervorgehoben, und diejenigen, die in anderen Top-Hits mutiert sind (gekennzeichnet mit speziellen Markierungen in c, weitere Details in der Ergänzung), werden blau angezeigt. c Ein phylogenetischer Baum wurde erstellt, indem der Abstand zwischen allen Sequenzen mithilfe der Blosum62-Substitutionsmatrix57 berechnet und der Baum durch Nachbarverknüpfung in Biopython58,59 konstruiert wurde. Die Farben zeigen das auf den Wildtyp normalisierte Aktivitätsniveau (FOWT). Markierungen: Quadrat = S92G_H133F_A433S_V470A, Raute = S92G_H133M_I167K_L432I_V470A, x = A93C_H133F_T322W_Y437N, Sternquadrat = I28R_S92G_H133F_V470A, großer Kreis = S92G_H133 F_R185E, Hexagramm = S92G_F109A_H133M_T503E, Wildtyp = Sanduhr; Alle anderen einzigartigen Varianten werden als kleiner Kreis angezeigt.

Entworfene Mutationen wurden mithilfe eines PCR-basierten Ansatzes, wie in den Methoden beschrieben, in Wildtyp-StlA und drei verbesserte StlA-Varianten eingeführt (siehe ergänzende Abbildung 3 und den umgebenden Text für die Herkunft der Vorlagen). Die konstruierte Plasmidbibliothek wurde in EcN umgewandelt, das unser Sensorsystem enthielt, und für die Zellsortierung mithilfe der Pop-and-Sort-Strategie vorbereitet. Nach der Inkubation in Tröpfchen wurden die Zellen per FACS sortiert, um die obersten 1 % der hellsten Zellen zu sammeln. Die resultierende Population zeigte einen Anstieg der mittleren TCA-Produktion einer Teilprobe mit 90 klonalen Varianten und war frei von der Mehrzahl der Varianten mit geringer Aktivität. Die zweite Pop-and-Sort-Runde, bei der die obersten 1 % der vorherigen Top-1-Prozent-Population isoliert wurden (oberstes 1 % – oberstes 1 % aus Abb. 1c), reichert die Population weiter an, sodass im Mittel eine Verbesserung von > 25 % gegenüber dem Wildtyp erzielt wird mit noch weniger Fehlalarmen. Die Pools „Top 1 %“ und „Top 1 %-Top 1 %“ zeigten beide signifikante Anreicherungen im Vergleich zu ihren scheinsortierten Kontrollen (p < 0,0001, Welchs ANOVA-Test mit Dunnetts T3-Mehrfachvergleichstest).

Nach der Anreicherung wurden etwa 1500 Klone für die plattenbasierte Bewertung der Gesamtzellaktivität ausgewählt, wie in den Methoden beschrieben, und verbesserte Varianten wurden sequenziert. Sechs verschiedene PAL-Varianten waren aufgrund ihrer unterschiedlichen Sequenzen (Abb. 3c) und Aktivitätsniveaus sowohl in anfänglichen In-vitro-Tests als auch in In-vitro-Simulations-(IVS)-GI-Modellexperimenten von besonderem Interesse (in Abb. 3b hervorgehobene Positionen, Sequenzen und Aktivität). in der Ergänzungstabelle 1). Der phylogenetische Baum in Abb. 3c zeigt, wie diese Varianten mit drei bis fünf Substitutionen vom Wildtyp abweichen. Allen sechs Varianten gemeinsam ist eine Mutation an Position 133 von Histidin zu Phenylalanin oder Methionin, die die Packung des Enzyms in der Nähe des aktiven Zentrums erhöht und mit der erhöhten Aktivität verbunden ist; Das Histidin des Wildtyp-Enzyms könnte möglicherweise seine zugehörige Helix verzerren, indem es den Carbonylsauerstoff von A129 stört. Fünf der sechs Top-Varianten enthalten außerdem eine S92G-Mutation am C-terminalen Teil der Helix, die möglicherweise zur Erhöhung der Flexibilität dient, indem sie die Wasserstoffbrückenbindung des Carbonylsauerstoffs stört. S92G befindet sich in der Nähe des aktiven Zentrums und könnte daher die Bindung und Freisetzung von Substrat und/oder Produkt beeinflussen. Diese Mutationen werden mit diversen zusätzlichen Substitutionen hinsichtlich Größe und Ladung kombiniert, wie durch ihre Abstände im Baum angezeigt (Abb. 3c). Weitere Spekulationen über die möglichen Auswirkungen der zusätzlichen Mutationen finden sich in der Ergänzungstabelle 2.

Beim Durchqueren des Gastrointestinaltrakts können Zellen auf verschiedene pH-Bedingungen stoßen, und es wurde beobachtet, dass die Gesamtzellaktivität von EcN, das Wildtyp-PAL exprimiert, stark vom pH-Wert der Umgebung abhängt (Abb. 4a). Wir wollten daher feststellen, ob Zellen, die entwickelte PAL-Enzyme exprimieren, ein ähnliches Aktivitätsprofil wie Wildtyp-PAL zeigten, wenn sie pH-Änderungen ausgesetzt waren. Bei allen getesteten Varianten wurde immer noch ein allgemeiner Trend einer verringerten Gesamtaktivität bei niedrigerem pH-Wert beobachtet (ergänzende Abbildung 4a – d), und die Aktivität wurde bei alkalischerem pH-Wert verbessert (ergänzende Abbildung 4d). Trotz einer allgemeinen Verringerung der Aktivität für alle Varianten bei pH 5 behielten die meisten Stämme zumindest zu späteren Zeitpunkten immer noch eine Verbesserung gegenüber dem Wildtyp bei (Abb. 4b, ergänzende Abb. 4e). Die Variante A93C_H133F_T322W_Y437N (Stamm-ID EP2495) zeigte jedoch unter dieser Bedingung keine gute Leistung, mit einem durchschnittlichen FOWT <1 nach 4 Stunden (Abb. 4b) und einer noch stärkeren Aktivitätsreduzierung zu früheren Zeitpunkten (ergänzende Abb. 4e). Für weitere Tests haben wir diese Variante nicht weiterverfolgt.

a Ganzzellige TCA-Produktion für EcN mit Wildtyp-StlA nach 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h oder 4 h bei pH 5, 6, 7 oder 8. n = 3 biologische Replikate mit einzelnen Datenpunkten dargestellt . b Ganzzellige PAL-Aktivität nach 4 Stunden bei pH 5, 6, 7 oder 8, normalisiert auf Wildtyp-StlA-Aktivität (Fold-over-Wildtyp, FOWT). n = 3 biologische Replikate ± sd c Gesamtzell-PAL-Aktivität nach 4 Stunden bei pH 7, getestet ohne pH-Behandlung (Kontrolle) oder nach 1 Stunde Inkubation bei pH 5 (pH-behandelt), normalisiert auf Wildtyp-StlA-Aktivität (FOWT). ). n = 3 biologische Replikate ± sd X-Achsenmarkierungen beziehen sich auf Stamm-IDs, EcN mit PAL-Varianten. EP2315: Wildtyp-StlA, EP2516: S92G_H133F_A433S_V470A, EP2525: S92G_H133M_I167K_L432I_V470A, EP2495: A93C_H133F_T322W_Y437N, EP2502: I28R_S92G_ H133F_V470A, EP2528: S92G_H133F_R185E, EP2526: S92G_F109A_H133M_T503E. Weitere Zeitpunkte und nicht normalisierte TCA-Produktionsdaten finden Sie in den ergänzenden Abbildungen 4 und 5.

Um die Wiederaufnahme der Stammaktivität nach Säurestress zu beurteilen, wurden die Zellen zunächst 1 Stunde lang bei 37 ° C einem Medium mit pH 5 ausgesetzt und dann bei neutralem pH auf Aktivität getestet (Abb. 4c, ergänzende Abb. 5). Im Gegensatz zu der sehr geringen Aktivität, die beim Test bei pH 5 beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 4a), konnten sich die Zellen von einer einstündigen Exposition gegenüber einem Medium mit pH 5 erholen und zeigten eine ähnliche Aktivität wie Kontrollzellen (Abb. 4c, ergänzende Abbildung 5a). ). Alle Stämme zeigten nach Exposition gegenüber pH 5 eine Verbesserung gegenüber der Wildtyp-StlA-Kontrolle (Abb. 4c, ergänzende Abb. 5b).

Zwei Varianten, S92G_H133F_A433S_V470A und S92G_H133M_I167K_L432I_V470A, schnitten bei beiden pH-Tests besonders gut ab und zeigten die höchste Aktivität bei neutralem pH-Wert. Das Zelllysat wurde für EcN vorbereitet, das jede dieser beiden Varianten und die Wildtyp-PAL-Kontrolle enthielt. Nach der Normalisierung des Gesamtproteingehalts zeigten Lysate beider Varianten im Vergleich zu Wildtyp-StlA signifikant erhöhte Vmax- und KM-Werte (Vmax p = 0,0058 und KM p = 0,0023 für EP2315 vs. EP2516, Vmax p = 0,0135 und KM p = 0,0008 für EP2315). vs. EP2525, basierend auf zweiseitigen t-Tests mit ungleicher Varianz; Tabelle 1), es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Varianten hinsichtlich Vmax oder KM.

Obwohl es keinen erkennbaren Unterschied zwischen den beiden charakterisierten Leit-PAL-Varianten gab, wurde die S92G_H133M_I167K_L432I_V470A-Variante, die fortan als mPAL (für mutiertes PAL) bezeichnet wird, ausgewählt, um SYNB1934 zu konstruieren, einen lebenden biotherapeutischen Stamm auf EcN-Basis, der für die Dosierung beim Menschen geeignet ist9. Diese Variante wurde gegenüber S92G_H133F_A433S_V470A ausgewählt, da sie kein zusätzliches Phe enthielt, das letztendlich zur Phe-Belastung in der Nahrung bei dosierten Probanden beitragen könnte, wenn die Zellen während des Transports lysiert würden. Zusätzlich zu den oben diskutierten S92G- und H133M-Mutationen umfasst die Variante I167K, L432I und V470A. Aus Gründen, die in der Ergänzungstabelle 2 ausführlicher erläutert werden, vermuten wir, dass L432I die Bindung/Freisetzung des Substrats beeinflusst, wohingegen I167K und V470A wahrscheinlich eine Rolle bei der Stabilisierung des Enzyms spielen. Dieser Stamm enthält mehrere Kopien des für mPAL kodierenden Gens, das in das Chromosom integriert ist, und aus Gründen der Biosicherheit eine Mutation des dapA-Gens, um eine Auxotrophie für die essentielle Zellwandkomponente Diaminopimelat zu erzeugen (Abb. 5a). SYNB1934 wurde auch entwickelt, um die gleichen zusätzlichen Phe-abbauenden Komponenten wie SYNB1618 zu exprimieren, nämlich den hochaffinen Phe-Transporter PheP und das alternative Phe-abbauende Enzym LAAD10. Wie bei SYNB1618 wurden alle bei der Entwicklung von SYNB1934 verwendeten Antibiotikaresistenzgene nach Abschluss der Stammkonstruktion entfernt.

Die optimierte Aktivität des PKU-Stammes wird mit SYNB1618 verglichen. Eine schematische Darstellung des Bakteriums SYNB1934 zeigt die wichtigsten gentechnisch veränderten Elemente, darunter die Gene, die für mPAL, PheP, LAAD kodieren, und die Deletion des dapA-Gens. b Die TCA-Produktion von 2,5 × 109 resuspendierten lyophilisierten SYNB1618- vs. SYNB1934-Zellen wurde in einer In-vitro-Simulation der Darmumgebung gemessen. n = 3 unabhängige biologische Dreifachversuche ± sd c und d NHP-Probanden erhielten oral einen 5 g Peptid- und 0,25 g d5-Phe-Bolus, gefolgt von einer Dosierung mit 1 × 1011 resuspendierten lyophilisierten SYNB1618- oder SYNB1934-Zellen. Die Plasmaflächen unter der Kurve (AUCs) für die stammspezifischen Biomarker TCA und d5-TCA werden angezeigt. Für c, n = 18 biologisch unabhängige NHP-Probanden pro Gruppe ± se. Für jeden Vergleich wurden die Daten mit einem zweiseitigen ungepaarten t-Test analysiert (p < 0,0001). Für die d5-HA-Konzentration im Urin normalisiert auf Kreatinin (d) n = 18 für mit SYNB1618 behandelte und 17 für mit SYNB1934 behandelte Probanden ± se (ein NHP in der mit SYNB1934 behandelten Gruppe konnte im Verlauf des Experiments keine Urinprobe produzieren). Die Daten wurden mithilfe eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests mit Welch-Korrektur (p = 0,0184) analysiert.

SYNB1934 wurde in einem vollständig kontrollierten Fermentersystem gezüchtet und auf Phe-Abbauaktivität hin zu einer hohen Zelldichte induziert, gefolgt von Waschen, Konzentrieren, Neuformulieren und Gefriertrocknung. Dieser Prozess simuliert die Herstellung eines Arzneimittels, das für die Dosierung durch den Menschen bestimmt ist. Resuspendiertes Material sowohl von lyophilisiertem SYNB1934 als auch von SYNB1618 zeigte eine hohe Lebensfähigkeit, gemessen durch einen Fluoreszenzfarbstoff-Ausschlusstest (Ergänzungstabelle 3). In In-vitro-GI-Simulationen zeigte resuspendiertes SYNB1934 einen signifikanten Anstieg der TCA-Produktionsrate um etwa das Zweifache im Vergleich zu SYNB1618 (Abb. 5b; einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest, p < 0,001).

Um die In-vivo-Aktivität von SYNB1934 mit der von SYNB1618 zu vergleichen, gingen wir als nächstes zu NHP-Studien über. Wir haben zuvor berichtet, dass Plasma-TCA als einzigartiger stammspezifischer Biomarker zur Verfolgung der PAL-Aktivität manipulierter Stämme verwendet werden kann; Die Verabreichung von Wildtyp-EcN führte nicht zum Nachweis dieses Metaboliten10. Nach einem oralen Bolus von Peptiden (Pepton) und deuteriertem Phe (d5-Phe) zeigten Tiere, die SYNB1934 erhielten, einen signifikanten Anstieg der Plasmaexposition gegenüber TCA und d5-TCA im Vergleich zu Tieren, die SYNB1618 erhielten (5,4 ± 1,0 gegenüber 2,9 ± 0,9). mM*h für TCA und 8,7 ± 2,0 vs. 4,6 ± 2,0 mM*h für d5-TCA; se; Abb. 5c). Darüber hinaus wird das von Stämmen in vivo produzierte TCA durch Leberenzyme quantitativ in Hippursäure (HA) umgewandelt und für die Urinausscheidung bestimmt10,35. Im Gegensatz zu Plasma-TCA ist HA im Urin ein häufiger Metabolit, der im Urin von Primaten vorkommt und zu erheblichen Hintergrundwerten führt10,35,36. Die Verwendung von oralem d5-Phe als metabolischer Tracer ermöglichte jedoch die Berechnung der HA-Ausscheidung im Urin, die speziell auf manipulierte Stämme zurückzuführen ist. Das liegt daran, dass es zwar viele aromatische Verbindungen gibt, die zu HA metabolisiert und gezielt ausgeschieden werden können, Phe jedoch nicht dazugehört10 und daher der einzige Stoffwechselweg von oralem d5-Phe zu d5-HA im Urin über d5-TCA verläuft Zwischenprodukt hergestellt von PAL. 6 Stunden nach der Dosierung war die d5-HA-Konzentration im Urin bei Tieren, die SYNB1934 erhielten, mehr als doppelt so hoch wie die von Tieren, die SYNB1618 erhielten (534,4 ± 107,0 vs. 249,1 ± 25,1 µg d5-HA/mg Kreatinin, se; Abb . 5d).

PKU wird typischerweise durch eine diätetische Einschränkung behandelt, was eine erhebliche Belastung für die Patienten darstellt. In vielen Fällen kann ein schlechtes Ernährungsmanagement zu einer verminderten Lebensqualität führen. Entwickelte synthetische Biotic™-Medikamente bieten das Potenzial für sichere, verträgliche, reversible und oral verabreichte Therapien für eine Vielzahl von Stoffwechselerkrankungen, einschließlich PKU. EcN wurde als ideales Bakterien-Chassis für die Stammentwicklung von Synthetic Biotic™ ausgewählt. Es wurde 1917 entdeckt und in der menschlichen Bevölkerung bei einer Vielzahl von Magen-Darm-Erkrankungen eingesetzt, darunter entzündliche Darmerkrankungen und Reizdarmsyndrom37,38. Es wurde auch berichtet, dass EcN mit dem Darmepithel interagiert, um entzündungshemmende Aktivitäten zu stimulieren und die Barrierefunktion zu verbessern und aufrechtzuerhalten39. Wichtig ist, dass EcN nach oraler Verabreichung bei gesunden Menschen keine langfristige Kolonisierung zeigt40. Die Begrenzung der Bakterienverweilzeit und die In-vivo-Replikation sind Eigenschaften, die vorhersagbare und reproduzierbare pharmakologische Eigenschaften analog zu herkömmlichen Therapeutika mit großen und kleinen Molekülen ermöglichen9. Der Einschluss von Auxotrophien in gentechnisch veränderte Stämme dient als Schutzmaßnahme, um vorhersehbare Ergebnisse zu gewährleisten und das Wachstum in der Umwelt nach der Ausscheidung zu begrenzen.

Diese Arbeit konzentrierte sich auf die Anwendung eines konstruierten aTF-Biosensors zur Verbesserung des Phe-abbauenden Enzyms PAL für einen klinischen PKU-Behandlungsstamm, gefolgt von der Entwicklung und präklinischen Erprobung eines verbesserten lebenden Biotherapeutikums, SYNB1934. Mithilfe der biosensorgesteuerten Fluoreszenzauslesung können Forscher an einem einzigen Tag Millionen von Genotypen phänotypisieren16. Allerdings hat das Übersprechen zwischen hoch- und niedrigproduzierenden Stämmen in der Vergangenheit zu Schwierigkeiten bei der Erzielung effektiver Anreicherungen für eine verbesserte Produktion geführt18. Hier stellen wir eine technisch einfache Methode, Pop 'n' Sort, vor, um die Diffusion mithilfe von Wasser-in-Öl-Emulsionen für Inkubationsschritte zu mildern und gleichzeitig einzelne Zellen statt vollständiger Tröpfchen durch FACS zu sortieren. Mithilfe der Pop-and-Sort-Methodik und unseres entwickelten Biosensors haben wir eine Bibliothek mit mehr als einer Million Mitgliedern auf eine verbesserte Ganzzell-PAL-Aktivität untersucht und Varianten mit verbesserter Aktivität identifiziert. Das mPAL, das im verbesserten therapeutischen Stamm verwendet wurde, enthielt fünf Mutationen im Vergleich zum Wildtyp-Enzym, von denen drei in der Nähe des aktiven Zentrums gezielt sind und wir gehen davon aus, dass sie eine Rolle bei der Bindung/Freisetzung des Substrats spielen, und zwei davon wahrscheinlich wirken stabilisierend.

In In-vitro-Zelllysat-Experimenten zeigte mPAL einen signifikant erhöhten Vmax- und KM-Wert. Um die Expression und Aktivität im endgültigen LBP so genau wie möglich nachzuahmen, wurden Protein-Tags nicht in die Konstruktion von Enzymbibliotheken einbezogen. Obwohl die kinetische Analyse des Zelllysats keine Entkopplung von kcat von der Enzymkonzentration in den angegebenen Vmax-Werten zulässt (siehe Tabelle 1), ist die Normalisierung auf den Gesamtproteingehalt repräsentativer für einen direkten Vergleich therapeutischer Stämme durchgeführt werden. Bemerkenswert ist, dass ein höherer KM mit der Hypothese im gesamten Projekt übereinstimmt, dass ein niedriger KM (höhere Bindungsaffinität des Substrats an ein Enzym) mit einer stärkeren Hemmung durch das Produkt TCA korrelieren könnte, das dem Substrat Phe strukturell sehr ähnlich ist. Obwohl die Charakterisierung der Hemmung bei Wildtyp-StlA und mPAL in dieser Arbeit nicht durchgeführt wurde, ist die Rückkopplungshemmung durch TCA ein gemeinsames Merkmal in vielen anderen kinetisch charakterisierten PALs41,42,43,44 und wird aufgrund der beobachteten erhöhten Aktivität für StlA angenommen im Zelllysat im Vergleich zu ganzen Zellen (Ergänzende Abbildung 1).

Stämme, die den menschlichen Magen-Darm-Trakt passieren, werden zweifellos einem schwankenden pH-Wert ausgesetzt sein. Die Auswirkung, die dies auf die Stammaktivität haben könnte, ist ein Parameter, der kürzlich mechanistisch für SYNB161845 modelliert wurde, und zukünftige Arbeiten werden darauf abzielen, eine ähnliche Modellierung für SYNB1934 durchzuführen. Alle in dieser Arbeit identifizierten PAL-Varianten zeigten weitgehend ähnliche Muster der Gesamtzellaktivität als Reaktion auf Änderungen des pH-Werts in der Umgebung, obwohl die meisten verbesserten Varianten unter denselben Bedingungen immer noch eine erhöhte Aktivität gegenüber Wildtyp-PAL zeigten. Es wird berichtet, dass PAL-Enzyme im Allgemeinen pH-Optima im basischen Bereich aufweisen43,46,47,48, wir gingen jedoch davon aus, dass sich E. coli erholen und seinen zytosolischen pH-Wert nahezu neutral halten würde, unabhängig vom pH-Bereich der Umgebung, der während dieser Studien getestet wurde49. Mit sinkendem pH-Wert wäre jedoch eine erhöhte Membranpermeabilität und eine zytosolische Akkumulation organischer Säuren wie TCA zu erwarten, was zu einer verstärkten Rückkopplungshemmung von PAL führen könnte. Zukünftige Arbeiten werden darauf abzielen, die Ursache der bei niedrigem pH-Wert beobachteten verringerten PAL-Aktivität ganzer Zellen aufzuklären, was möglicherweise die Entwicklung einer Sensoranwendung rechtfertigt, die mit dem Ultrahochdurchsatz-Screening unter sauren Bedingungen kompatibel ist. Die Unfähigkeit des in dieser Arbeit durchgeführten Screenings, das bei neutralem pH-Wert durchgeführt wird, Varianten mit erheblich verbesserter pH-Toleranz zu identifizieren, steht im Einklang mit dem, was häufig als erstes Gesetz der gerichteten Evolution bezeichnet wird: „Sie bekommen, wonach Sie suchen“50. Screens können entsprechend angepasst werden, um interessante Merkmale wie Aktivität bei unterschiedlichem pH-Wert, Temperatur, osmotischer Stärke usw. anzureichern. Allerdings gab es einige subtile phänotypische Unterschiede in der Reaktion der führenden PAL-Variantenstämme auf pH-Änderungen. Es wurden Varianten beobachtet, deren Aktivität bei niedrigem pH-Wert drastischer reduziert war als beim Wildtyp-Enzym, oder die bei steigendem pH-Wert eine erhöhte Änderungsrate der Aktivität gegenüber dem Wildtyp aufwiesen. Andere Varianten zeigten unabhängig vom pH-Wert der Umgebung die gleiche Verbesserung der Aktivität gegenüber dem Wildtyp-Enzym. Diese Ergebnisse unterstreichen die Vielfalt der gepoolten Mutantenbibliothek mit mehr als einer Million Mitgliedern, die bei Kopplung mit dem entsprechenden Screen/Sensor schnell für die Auswahl alternativer wünschenswerter Enzymeigenschaften eingesetzt werden kann.

In einer klinischen Studie der Phase 1/2a wurde gezeigt, dass SYNB1618 Phe verbraucht und es dosisabhängig in die erwarteten ungiftigen Metaboliten im menschlichen Darm sowohl gesunder Freiwilliger als auch PKU-Patienten umwandelt15. In dieser Studie wurde SYNB1618 nicht mit systemischer Toxizität in Verbindung gebracht und alle Probanden beseitigten die Bakterien innerhalb weniger Tage nach der letzten Dosis. Obwohl die Ergebnisse aufgrund der geringen Größe der PKU-Patientenkohorte nicht in der Lage waren, eine Änderung des Plasma-Phe zu erkennen, stützten sie die weitere Untersuchung von SYNB1618 in einer klinischen Phase-2-Studie, die eine größere Kohorte von PKU-Patienten umfasste (SynPheny-1; NCT04534842). Parallel dazu wurde SYNB1934 konstruiert und präklinisch getestet, wobei wir gezeigt haben, dass es SYNB1618 in vitro und in vivo übertrifft. Eine Phase-1-Studie zu SYNB1934 wurde kürzlich begonnen (NCT04984525). Im Vergleich zu SYNB1618 bietet SYNB1934 möglicherweise eine verbesserte Plasma-Phe-Senkung, die Möglichkeit einer geringeren Dosierung oder andere therapeutische Vorteile.

Für das Biosensor-Screening und die Charakterisierung von PAL-Varianten wurden das für StlA aus Photorhabdus luminescens11 kodierende Gen und die StlA-Varianten von Anhydrotetracyclin (aTc)-induzierbaren Plasmiden exprimiert, die Replikationsursprünge mit geringer Kopiezahl (pSC101) enthielten. Diese Plasmide kodierten für einen autoregulierten TetR und eine konstitutive Spectinomycin-Resistenzkassette; Zur Aufrechterhaltung des StlA-Plasmids wurden in allen Wachstumsschritten 100 µg/ml Spectinomycin bereitgestellt. Im Folgenden werden verschiedene Entwurfs- und Erstellungsansätze für Variantenbibliotheken beschrieben. Das Sensorsystem (technisch hergestellter TCA-Biosensor und biosensorregulierte Expression von gfp) war auf einem einzelnen High-Copy-Plasmid mit einem konstitutiven Ampicillin-Resistenzmarker enthalten; Zur Aufrechterhaltung des Sensorplasmids wurden in allen Wachstumsschritten 100 µg/ml Carbenicillin bereitgestellt.

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ Braunschweig, E. coli DSM 6601) erworben. Phe-abbauende klinische Kandidatenstämme wurden durch die Insertion von Genen in das EcN-Chromosom konstruiert. Der Aufbau von SYNB1618 wurde bereits beschrieben10. Die intergenen Loci malEK, araBC, yicS/nepI, agaI/rsmI, exo/cea und rhtBC wurden alle als geeignete Insertionsstellen identifiziert. Diese intergenen Regionen bestehen aus divergenten Promotoren oder konvergenten offenen Leserahmen, die durch eine beträchtliche DNA-Länge getrennt sind, sodass nicht zu erwarten ist, dass eingefügte Sequenzen zu polaren Effekten auf benachbarte Gene oder Promotoren führen. Chromosomeninsertionen in das EcN-Genom wurden mithilfe des gut charakterisierten Lambda-Red-Rekombinationsansatzes durchgeführt51. Für jede Insertion wurde (1) ein pKD3- oder pKD4-basiertes Plasmid mit 1000 bp 5'- und 3'-EcN-Genomhomologie für die Rekombination erstellt, gefolgt von (2) der isothermen Insertion des Gens/Promotors von Interesse in das Plasmid Assemblierung (HiFI DNA Assembly Master Mix, NEB), (3) Amplifikation des Insertionsfragments aus dem Plasmid durch PCR (einschließlich EcN-Homologieregionen und einer von der Flippase-Erkennungsziel-(frt)-Stelle flankierten Chloramphenicol- oder Kanamycin-Resistenzkassette für die anschließende Entfernung der Antibiotikakassette, Q5 High-Fidelity Master Mix, NEB), (4) Rekombination des Insertionsfragments durch Elektroporation über pKD46 und anschließende pKD46-Entfernung und (5) die Entfernung von Antibiotikaresistenzkassetten über pCP20 und anschließende pCP20-Entfernung. Alle DNA-Sequenzen für genomische Insertionen, die bei der Konstruktion von SYNB1618 und SYNB1934 verwendet werden, sind auf Anfrage erhältlich.

Zur Deletion des dapA-Gens wurden zwei PCR-Runden mit verschachtelten Primern durchgeführt. Für die erste PCR-Runde wurde pKD3 als Matrizen-DNA verwendet. Die Primer wurden entwickelt, um ein dsDNA-Fragment zu erzeugen, das Homologie neben dem dapA-Genlocus im EcN-Chromosom und ein von frt-Stellen flankiertes Chloramphenicol-Resistenzgen enthielt. Die in der zweiten PCR-Runde verwendeten Primer verwendeten das PCR-Produkt der ersten Runde als Matrizen-DNA. EcN, das pKD46 enthielt, wurde durch Elektroporation mit dem dapA-Knockout-Fragment transformiert. Die Kolonien wurden auf LB-Agar selektiert, der Chloramphenicol (30 μg/ml) und Diaminopimelat (Sigma, D1377; 100 μg/ml) enthielt.

Die gesamte Elektroporation wurde in einem Eppendorf Eporator (1,8-kV-Puls, Elektroküvetten mit 1 mm Spaltlänge) durchgeführt. Transformierte Zellen wurden als Kolonien auf LB-Agar (Sigma, L2897) ausgewählt, der 100 μg/ml Carbenicillin und gegebenenfalls 50 μg/ml Kanamycin enthielt.

Phenylalanin wurde von VWR (Katalognummer 97062-556) oder Sigma (Katalognummer P2126) bezogen und M9-Salze wurden von Fisher (Katalognummer DF0485-17) bezogen. Aktivierte Biomasse wurde auf Ganzzellaktivität in M9 (6,8 g/L Na2HPO4 + 3 g/L KH2PO4 + 0,5 g/L NaCl + 1 g/L NH4Cl) + 0,5 % Glucose + 40 mM Phenylalanin untersucht. Für sensorbasierte Screens wurde eine angepasste minimale M9-Glukoserezeptur mit reduzierter Phenylalaninkonzentration verwendet: 1 % Glukose + 13,6 g/L Na2HPO4 + 6 g/L KH2PO4 + 1 g/L NaCl + 2 g/L NH4Cl + 1 % LB Lennox + Spurenmetalle (0,0002 % C6H8FeNO7, 1,8 mg/L ZnSO4·7 H2O, 1,8 mg/L CuSO4·5 H2O, 1,2 mg/L MnSO4·H2O, 1,8 mg/L CoCl2·6 H2O) + Antibiotikum zur Plasmiderhaltung + 200 ng/ml aTc für die Expression der stlA-Variante + 10 mM L-Phenylalanin als Substrat.

Ein spezifischer TCA-responsiver aTF-Biosensor wurde mithilfe der proprietären Sensorentwicklungsplattform von Zymergen entwickelt. Es wurde aus einer Bibliothek entworfener Sensoren angereichert, indem auf einem FACS ein hohes GFP pro Zelle in Gegenwart von TCA und ein niedriges Hintergrund-GFP pro Zelle in Abwesenheit von TCA selektiert wurde. Top-Biosensorkandidaten wurden außerdem hinsichtlich ihrer Spezifität für TCA gegenüber verwandten Liganden im Produktionswirt EcN sowie ihrer Korrelationen mit produziertem TCA unter Verwendung von StlA-Varianten bekannter Aktivitätsniveaus charakterisiert (Abb. 1b).

Mit RosettaCM32 wurde ein Homologiemodell von StlA erstellt. Vorlagen wurden mithilfe von HHblits und HHsearch52 durch Durchsuchen der Pfam- und PDB70-Datenbanken identifiziert. Die 10 PDB-Vorlagen mit der höchsten Punktzahl wurden dann von RosettaScripts53 mit der Beta-Energiefunktion54 verwendet, um ein Ensemble von Homologiestrukturen zu erstellen; Es wurden 200 Täuschkörper erzeugt und die niedrigste Energie ausgewählt. Der in dieser Analyse verwendete Code sowie Anweisungen finden Sie im folgenden GitHub-Repository: https://github.com/Zymergen/AdolfsenIsabella_NatComm.

Um Bibliotheken für die Zielenzyme zu entwerfen, verwendeten wir drei Ansätze: phylogenetische Analyse, koevolutionäre Analyse und Strukturanalyse.

Um die phylogenetische Analyse durchzuführen, wurde ein PSSM mit PSI-BLAST33 generiert (typischerweise unter Verwendung der Standardeinstellungen von e-Wert = 0,01 und Iterationen = 3) und zur Bewertung einzelner Substitutionen der Wildtyp-StlA-Sequenz verwendet. Die resultierende Matrix enthält eine Bewertung für jede mögliche Aminosäure an jeder Position im Protein, entsprechend der Häufigkeit der Aminosäure an dieser Position im Satz homologer Sequenzen, die von PSI-BLAST zurückgegeben werden. Diese potenziellen Substitutionen wurden mit dem Score für den Wildtyp-Rest an dieser Position verglichen und, wenn deutlich höher bewertete Substitutionen (typischer Cutoff: Z-Score >2) vom PSSM verfügbar waren, wurde die Aminosäure an dieser bestimmten Position ausgewählt experimentelle Überprüfung.

Um die Analyse um Restkopplungen zu erweitern, wurde eine Koevolutionsanalyse für StlA mit GREMLIN34 durchgeführt und alle Kopplungen analysiert und optimiert. Für Positionen, an denen die Kopplung laut Analyse nicht optimal war, wurde die optimalste Aminosäuresubstitution ausgewählt, um sie experimentell zu testen.

Um schließlich auf das aktive Zentrum zu zielen, wurden Positionen in der Nähe des aktiven Zentrums mithilfe des Homologiemodells identifiziert (Modellgenerierung im vorherigen Abschnitt beschrieben). Wenn diese Positionen in der phylogenetischen Analyse beobachtet wurden (PSSM-Score > 0), wurden sie zur experimentellen Validierung in die Bibliothek aufgenommen.

Die Bibliothek wurde in vier Vorlagen eingebaut: Wildtyp-StlA und drei Varianten, die in frühen Entwicklungsbemühungen eine verbesserte Leistung gezeigt hatten (H133M_I167K_V207I, S92G_H133F_Y437N und A93C_H133M_I167K, die alle eine 20–40 % höhere Aktivität gegenüber Wildtyp-StlA aufwiesen). Die StlA-Variantentemplates, die jeweils in einem aTc-induzierbaren Plasmidrückgrat mit geringer Kopienzahl untergebracht sind, wurden in einem äquimolaren Verhältnis gemischt, um das Plasmidtemplate für einen Ansatz zum Aufbau einer Oligo-basierten Bibliothek bereitzustellen. Ein separates Primerpaar (Supplementary Data) wurde entwickelt, um jede der Zielmutationen durch eine einteilige Golden-Gate-Reaktion einzuführen, wobei inverse PCR55 verwendet wurde, um das gesamte Plasmid an der Zielmutationsstelle zu amplifizieren. Für die 130 Zielmutationen wurden 130 separate PCRs (Q5 High-Fidelity Master Mix, NEB) durchgeführt. Eine Teilprobe jeder Reaktion wurde auf einem Agarosegel laufen gelassen, um eine Quantifizierung der relativen Bandenintensität zu ermöglichen, die zur Normalisierung und Zusammenführung der 130 PCR-Produkte verwendet wurde. Die gepoolten Produkte wurden mit DpnI verdaut und gelgereinigt, dann mit NEB Golden Gate Mix (BsaI-v2) 1 Stunde lang bei 37 °C zirkularisiert, gefolgt von einer 5-minütigen Hitzeinaktivierung bei 60 °C. Die gepoolte zirkularisierte Bibliothek von 130 Mutationen × 4 Templates wurde unter Verwendung des NEB-Protokolls in elektrokompetente NEB10β-Zellen transformiert. Die gewonnenen Kulturen wurden zur Selektion der Transformanten über Nacht in LB mit Antibiotika überführt, und eine Teilprobe wurde auf LB-Agarplatten mit Antibiotika ausplattiert, um eine ausreichende Bibliotheksabdeckung zu bestätigen. Dieser Vorgang wurde noch zweimal wiederholt, wodurch nach einem zweiten Zyklus kombinatorische Bibliotheken aus einer und zwei Kombinationen entworfener Mutationen und nach einem dritten Zyklus eine, zwei und drei Kombinationen entworfener Mutationen erzeugt wurden. Für den zweiten und dritten Klonierungszyklus wurde das Bibliotheksplasmid aus der Übernacht-Selektionskultur gereinigt und als Matrize in der anschließenden Runde der PCR-Mutagenese verwendet. Nach drei Klonierungszyklen wurde die aTc-induzierbare, >1 Million Mitglieder umfassende Bibliothek mit geringer Kopiezahl in einen Wildtyp-Wirtsstamm von E. coli Nissle (EcN) transformiert, der das Sensorsystem auf einem Plasmid mit hoher Kopiezahl enthielt.

Um das Übersprechen während der TCA-Produktion und der Sensorreaktion zu reduzieren, wurden die Zellen in mikrofluidisch erzeugten Wasser-in-Öl-Tröpfchen eingekapselt. Den Bibliotheken wurden 10 ml LB+-Antibiotikum (siehe „Plasmide“ oben) in 25-mm-Reagenzgläsern aus einem ausreichenden Volumen an Glycerin-Lagerbeständen bei −80 °C inokuliert, um die Komplexität der Bibliotheken aufrechtzuerhalten. Die Kulturen wurden über Nacht ca. 16 Stunden bis zur Sättigung inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde 1 ml der Kultur 1 Minute lang bei 17.800 × g zentrifugiert und das Pellet in einem gleichen Volumen gefiltertem Sensor-Response-Medium resuspendiert (siehe „Assay-Medien“ oben). Die OD600 der gewaschenen Zellen wurde auf einem Genesys 20-Spektrophotometer mit 20-facher Verdünnung gemessen und die Zellen wurden im gleichen Medium auf eine OD600 von 0,03 verdünnt. Ein OD600 von 0,03 führt dazu, dass zum Zeitpunkt 0 durchschnittlich etwa eine Zelle pro 40 µm-Tröpfchen eingekapselt ist.

Tröpfchen wurden in Sphere Fluidics-Öl (Pico-SurfTM 1, 2 % in NovecTM 7500, Chargennr. 031117-1 – verdünnt auf 1 % Tensid in zusätzlichem NovecTM 7500) mit einer Rate von ~3,4 kHz in einem strömungsfokussierenden Mikrofluidikgerät erzeugt. intern als PDMS-Chips auf Glas hergestellt. Die Tröpfchen wurden in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen gesammelt und etwa 16 Stunden lang bei 33 °C in einem Standinkubator ohne Taumeln inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Emulsionen durch Zugabe einer ausreichenden Menge 1H-, 1H-, 2H-, 2H-Perfluor-1-octanol (Sigma), Vortexen für ca. 15 s und Pulsrotieren für ca. 1 s in einer VWR Galaxy Minizentrifuge aufgebrochen, um die Emulsionen zu trennen organische und wässrige Schichten. Die wässrige Schicht enthält die aus den Tröpfchen freigesetzten Zellen. Die wässrige Phase der gebrochenen Emulsionen wurde vor der Zellsortierung 100-fach in filtrierter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt.

Die Zellen wurden auf einem Bio-Rad S3E-Zellsortierer mit einer Zielereignisrate von 1500 Ereignissen/s sortiert, wobei die Proben- und Sammelkammern unter Verwendung der ProSortTM-Softwareversion 1.6.0.12 bei Raumtemperatur gehalten wurden. Die Ereignisse wurden in 5-ml-Polypropylen-Röhrchen mit Schnappverschluss (Falcon) gesammelt, die ein Anfangsvolumen von 0,5 ml LB enthielten. Ereignisse wurden mithilfe von drei Metriken gesteuert: einem elliptischen SSC-Area vs. FSC-Area-Gate, um EcN-Zellen ähnlicher Größe zu isolieren, einem FSC-Height vs. FSC-Area-Gate, um jegliche Dubletts auszuschließen, und einem GFP-Area (FITC-A). Gate zur Auswahl von Zellen basierend auf einer starken Sensorreaktion. Diese Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 6 veranschaulicht. Das sortierte Volumen wurde in ausreichend LB Lennox + Antibiotikum für die Erholung über Nacht bei 33 °C und 220 U/min verdünnt. Um Bedenken hinsichtlich einer genetischen Drift aufgrund mehrerer Auswüchse zu vermeiden, wurden die StlA-Plasmide aus wiederhergestellten Populationen gereinigt und vor der Durchführung nachfolgender Sortierungen in frisches EcN transformiert, das das Sensorplasmid enthielt.

150 µL LB Lennox + Antibiotikum in Standardplatten mit 96 Vertiefungen (VWR-Katalognummer 82050-772) wurden aus Kolonien von E. coli Nissle, die Expressionsplasmide der StlA-Variante und Sensorplasmide enthielten, inokuliert. Diese Vorkulturplatten wurden über Nacht bei 33 °C und 750 U/min in einem Incu-Mixer MP-Inkubator (Benchmark Scientific) inkubiert, der mit einer porösen VWR-Folie (VWR-Katalognummer 60941-086) bedeckt war.

Die Vorkulturen über Nacht wurden im Verhältnis 1:100 in 1 ml LB Lennox + Antibiotikum in Deep-Well-96-Well-Platten (VWR-Katalognummer 89047-264) inokuliert. Die Platten wurden mit einer porösen VWR-Folie bedeckt und in einem Incu-Mixer bei 33 °C und 1500 U/min 2 Stunden lang bis zur exponentiellen Phase inkubiert. Nach 2 Stunden wurden alle Vertiefungen mit 200 ng/ml aTc (Endkonzentration, VWR-Katalognummer 200002-828) induziert und für 4 Stunden bei 33 °C und 1500 U/min wieder in den Incu-Mixer gestellt, wiederum abgedeckt mit einer porösen VWR-Folie. Alle übrigen Schritte wurden bei 4 °C/auf Eis durchgeführt. Nach 4 Stunden wurden die Platten 10 Minuten lang bei 3214 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Pellets wurden in 250 µL kaltem PBS gewaschen. Die Platte wurde erneut 10 Minuten lang bei 3214 × g zentrifugiert und dekantiert. Die Pellets wurden in 30 µL kaltem PBS resuspendiert (~40 µL endgültig mit Zellpellet). Dazu wurden 40 µL kaltes 50 % Glycerin hinzugefügt, was zu einer OD600~25-Zubereitung führte. Die Zellpräparate wurden in gekühlte 96-Well-PCR-Platten überführt, mit Folie abgedeckt und bis zum Test bei –80 °C gelagert.

Für den Assay wurden Aliquots der 96-Well-PCR-Platte zur Zubereitung aktivierter Biomasse bei 4 °C aufgetaut, und 4 µL jeder OD600 = 25 aktivierten Biomasse wurden über eine 96-Well-PCR-Platte aliquotiert und bis zum Beginn des Assays auf Eis gelagert. Um den Assay zu starten, wurden 96 µL vorgewärmter (37 °C) Assay-Puffer (M9 0,5 % Glucose 40 mM Phenylalanin) zu den 4 µL aktivierter Biomasse gegeben, gemischt, mit Folie abgedeckt und in den 37 °C warmen statischen Behälter gegeben Inkubator. Nach 4 Stunden wurden die Zellen durch 10-minütige Zentrifugation bei 3214 × g und 4 ° C pelletiert. Nach dem Pelletieren wurde TCA aus den Überständen in einem Synergy H1-Mikroplattenlesegerät bei einer Absorption von 290 nm in UV-Star-Mikroplatten (Greiner-Katalognummer 655801) quantifiziert, nachdem es in Wasser bis in den linearen Bereich des Geräts verdünnt worden war. Das Endvolumen in der Platte betrug 150 µL. Eine Standardkurve wurde verwendet, um A290-Messungen mit trans-Zimtsäure von Sigma (Katalognummer C80857) in TCA (mM) umzuwandeln. Die aus ausgewählten Varianten erzeugten TCA-Konzentrationen wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestätigt. Für Fold-over-Wildtyp-Normalisierungen (FOWT) wurden die TCA-Variantenspiegel durch die gemittelten Wildtyp-TCA-Werte aus demselben Assay dividiert.

Während der weiteren Charakterisierung der Top-PAL-Varianten wurde die aktivierte Biomasse während der Aktivitätstests sorgfältiger auf OD600 = 1 normalisiert. Kulturröhrchen mit 10 ml LB Lennox + Antibiotikum wurden 1:100 aus 3 ml LB Lennox + Antibiotikum bei 33 °C 220 U/min Vorkulturen über Nacht beimpft. Diese wurden 2 Stunden lang bei 33 °C und 220 U/min inkubiert. Anschließend wurden sie mit 200 ng/ml aTc induziert und wieder in den Inkubator mit 33 °C und 220 U/min gegeben. Alle übrigen Vorbereitungsschritte wurden auf Eis/bei 4 °C durchgeführt. Nach 4 Stunden Induktion wurden die Kulturen in konische 15-ml-Röhrchen (Falcon) überführt und 10 Minuten bei 3214 × g zentrifugiert, in 1 ml kaltem PBS resuspendiert und in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt. Anschließend wurden sie noch einmal in 1 ml kaltem PBS (17.800 × g 1 Minute in einer Mikrozentrifuge) gewaschen und ein letztes Mal in 300 µL PBS resuspendiert. OD600-Messungen wurden in Küvetten durchgeführt und die Zellen wurden in 300 µL kaltem PBS auf OD600 = 50 normalisiert. Zu den 300 µL OD600 = 50 in PBS-Proben wurden 300 µL kaltes 50 % Glycerin für eine endgültige OD600 = 25 hinzugefügt. Aliquots wurden für jeden Stamm auf PCR-Röhrchen verteilt und bei –80 °C gelagert, bis der aktivierte Biomassetest durchgeführt werden konnte .

Für die bei verschiedenen pH-Werten durchgeführten Tests (Abb. 4b) wurde aktivierte Biomasse bei 4 ° C aufgetaut und in M9 0, 5% Glucose 40 mM Phe auf OD600 = 1 verdünnt und in 96-Well-Mulden auf pH 5, 6, 7 oder 8 titriert PCR-Platten. Die Platte wurde mit Folie abgedeckt und 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die PCR-Platten wurden dann 10 Minuten lang bei 3214 × g und 4 °C zentrifugiert und die Überstände wurden durch Absorption bei 290 nm quantifiziert, wie oben in „Plattenbasierter aktivierter Biomassetest für die TCA-Produktion aus Stämmen“ beschrieben.

Für Tests, die nach der Erholung von einem niedrigen pH-Wert durchgeführt wurden (Abb. 4c), wurden die Aliquots der aktivierten Biomasse aufgetaut und in M9 0,5 % Glucose bei pH 5 (kein Phe) in PCR-Platten mit 96 Vertiefungen auf OD600 = 1 verdünnt. Die Platten wurden 1 Stunde lang ohne Schütteln bei 37 °C inkubiert, 10 Minuten lang bei 3214 × g und 4 °C zentrifugiert und in PBS gewaschen. Anschließend wurden sie bei neutralem pH-Wert auf die Aktivität aktivierter Biomasse getestet, wie in „Aktivierte Biomasse auf Plattenbasis“ beschrieben „Test zur TCA-Produktion aus Stämmen“ oben. Um den Zellverlust während der Waschschritte zur Entfernung des pH-5-Mediums zu kontrollieren, wurde frische aktivierte Biomasse zu PCR-Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, zusammen mit den bei pH 5 inkubierten Proben gewaschen und dann auf die Aktivität aktivierter Biomasse untersucht. Diese Proben sind in Abb. 4c mit „Kontrolle“ gekennzeichnet. Für FOWT-Normalisierungen wurden die TCA-Variantenspiegel durch die gemittelten Wildtyp-TCA-Werte aus demselben Test dividiert.

In EcN wurde eine Reihe von PAL-exprimierenden Stämmen konstruiert, darunter Stämme (2) mit einer einzelnen chromosomalen Insertion von stlA an getrennten Stellen, ein Stamm, der beide chromosomalen stlA-Genkopien im gleichen Hintergrund enthielt, und ein Stamm mit einer stlA mit geringer Kopienzahl -exprimierendes Plasmid (pSC101-Ursprung) und ein Stamm mit einem stlA-exprimierenden Plasmid mit hoher Kopienzahl (pUC-Ursprung). In jedem dieser Stämme wurden die gleiche stlA-Kodierungssequenz, die gleiche Ribosomenbindungsstelle und der gleiche aTc-induzierbare Promotor verwendet, sodass der einzige Unterschied zwischen den Stämmen in den Orten der chromosomalen Insertion und/oder der Kopienzahl des stlA-Gens bestand. Für das Stammwachstum und die PAL-Induktion wurden 50-ml-Kolben mit Schikanen mit 10 ml LB-Lennox-Brühe, die entsprechende Antibiotika enthielt, im Verhältnis 1:100 aus Übernachtkulturen beimpft. Die Kolben wurden unter Schütteln bei 37 °C und 250 U/min in einem Eppendorf-Orbitalschüttler 2 Stunden lang wachsen gelassen, um die Kulturen in die exponentielle Phase zu bringen. Zu diesem Zeitpunkt wurde aTc in einer Menge von 200 ng/ml aTc zugegeben (Endkonzentration, VWR-Katalognummer 200002-828). Man ließ die Zellen weitere 4 Stunden lang induziert wachsen, bevor sie 10 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert und die Pellets in einem gleichen Volumen eiskalter PBS resuspendiert wurden.

Um die PAL-Aktivität ganzer Zellen zu messen, wurden Stämme bis zu einer OD600 von 0,1 in 1 ml Phe-Assaypuffer (M9 0,5 % Glucose, enthaltend 40 mM Phe) in Mikrozentrifugenröhrchen resuspendiert und in einen 37 °C-Wärmeblock gegeben. Die Proben wurden 2 Stunden lang alle 30 Minuten entnommen und die TCA-Konzentration wurde durch OD290-Messung wie oben beschrieben bestimmt. Die TCA-Produktionsraten wurden aus der über die Zeit im Überstand gemessenen TCA-Konzentration extrapoliert.

Um die PAL-Aktivität aus Lysaten zu messen, wurde ein 6-ml-Volumen resuspendierter Zellen bei einem Druck von 18.000 psi durch einen Microfluidics™ LV1 Low Volume Microfludizer®-Homogenisator geleitet. Jeder Stamm wurde dreimal durch den Homogenisator geleitet, um eine vollständige Lyse sicherzustellen. Die resultierenden Lysate wurden 20 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert, um unlösliches Material zu pelletieren. Die Gesamtkonzentration an löslichem Protein für jedes geklärte Lysat wurde mittels BCA-Assay (Pierce, Katalognummer 23227) bestimmt. Die TCA-Produktionsraten wurden ähnlich wie bei der oben beschriebenen Methode für ganze Zellen bestimmt, mit der Ausnahme, dass 30 mg lösliches Protein verwendet wurden, um PAL für den Test bereitzustellen, anstatt die Zellen erneut zu suspendieren.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gele (SDS-PAGE) wurden unter Verwendung ganzer Zellen von WT EcN und der oben beschriebenen gentechnisch veränderten Stammserie durchgeführt. Die Zellen wurden wie beschrieben gezüchtet und induziert. Ganze Zellen jedes induzierten Stamms wurden auf eine OD600 von 0,5 resuspendiert und in 1 × Lithiumdodecylsulfat-Probenladepuffer 15 Minuten lang gekocht (Invitrogen, Katalognummer NP0007). Ein 20-μL-Volumen jeder Probe wurde auf ein 4–12 %iges Bis-Tris-Stapel-SDS-PAGE-Gel (Invitrogen, Katalognummer NP0322) geladen. Als Standards wurde iBright Prestained Protein Ladder (Invitrogen, Katalognummer LC5615) einbezogen, um die Proteingröße abzuschätzen. Die Gele wurden 30 Minuten lang in MES-SDS-Puffer (Invitrogen, Katalognummer NP0002) bei 200 V laufen gelassen und mit SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, Katalognummer LC6065) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt.

Aktivierte Biomasse wurde aus 10-ml-Kulturröhrchen wie im obigen Abschnitt beschrieben hergestellt und dann zur Bestimmung der kinetischen Parameter lysiert. Zur Herstellung des Lysats wurden aufgetaute Biomasseproben verdünnt und mit einem Branson Digital Sonifier mit Mikrospitze beschallt. Anschließend wurde der lösliche Anteil der Lysatproben für den kinetischen Assay verwendet. Das Gesamtprotein in den Lysatproben wurde mit dem Bradford-Assay gemessen und alle Proben wurden für den kinetischen Assay auf eine Gesamtproteinbeladung von 10 µg pro Vertiefung normalisiert. Die Lysatproben wurden in M9 0,5 % Glucose mit Phe-Konzentrationen im Bereich von 40 mM Phe bis 39 μM mit zweifacher Verdünnung inkubiert (Assay-Puffer ohne Phe wurde auch als Kontrolle einbezogen). Der kinetische Assay wurde in UV-Star-96-Well-Mikroplatten (Greiner) durchgeführt, wobei TCA jede Minute durch A290-Messungen unter Verwendung eines BioTek Synergy H1-Mikroplattenlesegeräts quantifiziert wurde, das auf statische Inkubation bei 37 °C eingestellt war. Die Michaelis-Menten-Modellanpassung wurde unter Verwendung einer nichtlinearen Regression (nls-Funktion in R mit der Formel V = (Vmax * [S])/(KM + [S])) für die Geschwindigkeitsdaten aus drei Chargenreplikaten durchgeführt. Beispielhafte Modellanpassungen finden Sie in der ergänzenden Abbildung 7. Die in der nichtlinearen Regression verwendete Rate V wurde ab der ersten Aktivitätsstunde für jede getestete Phe-Konzentration berechnet, wobei die Aktivität linear blieb.

Alle Stämme wurden in Fermentationsmedien gezüchtet, die wie folgt zubereitet wurden: Hefeextrakt (40 g/L), K2HPO4 (5 g/L), KH2PO4 (3,5 g/L), (NH4)2HPO4 (3,5 g/L), MgSO4*7H2O (0,5 g/L), FeCl3 (1,6 mg/L), CoCl2*6H2O (0,2 mg/ml), CuCl2 (0,1 mg/L), ZnCl2 (0,2 mg/L), NaMoO4 (0,2 mg/L). ), H3BO3 (0,05 mg/L), Glycerin (25 g/L), Antischaum 204 (125 μL/L). Die Produktion der Stämme begann mit dem Auftauen eines Fläschchens aus einer Zellbank und dem Kultivieren von 1 ml des aufgetauten Fläschchens in 50 ml Fermentationsmedium, ergänzt mit Diaminopimelat (300 µg/ml), in einem 500 ml Ultra-Yield™-Kolben (Thomson Instrument Company). Die Zellen wurden unter Schütteln bei 375 U/min gezüchtet, bis eine OD600 von 10–15 erreicht war. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturen zum Animpfen von 24,5 l Medium in einem HyPerforma™ Thermo Scientific 30-l-Einwegfermenter mit einer anfänglichen OD600 von 0,000016 verwendet. Der Fermenter wurde unter Verwendung von Ammoniumhydroxid auf 37 °C, eine Konzentration von gelöstem Sauerstoff (DO) von 60 % und einen pH-Wert von 7 geregelt. Für SYNB1618 wurden die Zellen bei einer OD600 von 1,5 durch die Schaffung einer sauerstoffarmen Umgebung (10 % DO) und die Zugabe von Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG, 1 mM) aktiviert. Zu diesem Zeitpunkt wurde auch mit einer Nährstoffzufuhr begonnen (15 ml/Lh von 271,75 g/L Hefeextrakt, 86,27 g/L Glycerin) und bis zum Ende der Fermentation fortgesetzt. 3,5 Stunden nach der Zugabe von IPTG wurde die Nährstoffzufuhrrate auf 30 ml/lh verdoppelt. Für SYNB1934 wurden die Zellen bei einer OD600 von ~1,5 durch die Zugabe von IPTG (1 mM) aktiviert und der DO wurde bei 30 % gehalten. Zu diesem Zeitpunkt wurde auch mit einer Nährstoffzufuhr begonnen (11,25 ml/Lh von 271,75 g/L Hefeextrakt, 86,27 g/L Glucose) und 3,5 Stunden lang fortgesetzt. Nach 3,5 Stunden wurde die Nährstoffzufuhrrate für einen Zeitraum von 2,75 Stunden auf 22,5 ml/Lh verdoppelt. Bei beiden Stämmen wurde der Fermentation in der letzten Stunde der Fermentation L-Arabinose zugesetzt (Endkonzentration 10 mM). Der Kontrollstamm SYN094, der keine Phe-Abbaukomponenten enthält, wurde in einem 5-L-Bioreaktor in Fermentationsmedien gezüchtet, die einen konstanten DO-Gehalt von 30 % lieferten, bis die stationäre Phase erreicht war. Die Stämme wurden durch Tangentialflussfiltration (TFF) geerntet.

Am Ende der TFF wurde der Überstand verworfen und die Zellen wurden auf eine Endkonzentration von 150 OD600 in lyoprotektivem Puffer (10 % Gew./Vol. Trehalose, 50 mM Tris, pH 7,5) resuspendiert. Die formulierte Zellsuspension wurde zum Abfüllen von 2-ml-Braunglasfläschchen verwendet und auf einen Endwassergehalt von <5 % lyophilisiert. Lyophilisiertes Material wurde bei 4 °C gelagert. Getrocknetes lyophilisiertes Pulver wurde mit PBS (Quality Biological, 114-056-101) rekonstituiert, um dem Volumen vor der Lyophilisierung zu entsprechen. Diese rekonstituierte Zellsuspension wurde zur Messung der Aktivität und Lebensfähigkeit verwendet.

Um die Lebensfähigkeit der Bakterienzellen zu bestimmen, wurden resuspendierte Zellen verdünnt und mit SYTOX Green-Nukleinsäurefärbung (Life Technologies) gefärbt. Lebende und tote gefärbte Zellen wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers direkt auf einem Nexcelom Bioscience Cellometer X2 Bildzytometer gezählt.

Das In-vitro-Magensimulationsmodell wurde entwickelt, um Schlüsselaspekte der oralen Verabreichung beim Menschen zu simulieren, einschließlich der Magensauerstoffkonzentration, der Pepsinsekretion und des Magen-pH-Werts. Der IVS-Assay besteht aus Inkubationen im 96-Well-Mikrotiterplattenformat, die darauf ausgelegt sind, die Magenbeschwerden beim Menschen zu simulieren56. Kurz gesagt, lyophilisierte Zellen wurden bei Raumtemperatur in PBS resuspendiert. Die Bakterienzellkonzentrationen wurden durch die Zählung lebensfähiger und/oder Gesamtzellen bestimmt. Aliquots der Zellen wurden in 0,077 M Natriumbicarbonatpuffer mit 5,0 × 109 Zellen pro ml resuspendiert. Diese Lösung wurde dann mit gleichen Teilen simulierter Magenflüssigkeit56, die 20 mM Phe enthielt, gemischt und 2 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln in einer auf 2 % Sauerstoff kalibrierten In-vitro-Hypoxiekammer aus Polycarbonat (Coy Lab Products) inkubiert. Die resultierende SYNB1618-Zelldichte in SGF betrug 2,5 × 109 Zellen/ml. Um die PAL-Aktivität zu bestimmen, wurden SGF-Aliquote in regelmäßigen Abständen gesammelt und 5 Minuten lang bei 5000 × g unter Verwendung einer Tischzentrifuge zentrifugiert, gefolgt von einer Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Quantifizierung von Metaboliten, einschließlich Phe und Transcinnamat ( PBS).

NHP-Studien wurden in Charles River Labs (Shrewsbury, MA) in Übereinstimmung mit allen anwendbaren Abschnitten der Final Rules of the Animal Welfare Act (Code of Federal Regulations, Titel 9) und der Public Health Service Policy on Humane Care and Use of durchgeführt Labortiere vom Office of Laboratory Animal Welfare und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren vom National Research Council. Es wurden zwölf männliche Cynomolgus-Affen im Alter von 2–5 Jahren verwendet (2,5–4 kg), die mit International Certified Primate Chow (PMI Nutrition, 5048) gefüttert wurden. Standardarbeitsanweisungen für NHP-Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Charles River Laboratories überprüft und genehmigt. Alle Tiere in der Kohorte waren zu Beginn der Studie in einem guten Gesundheitszustand und wurden zwischen den Studien mindestens sieben Tage lang ausgewaschen. Es wurden drei Einzeldosisstudien durchgeführt, um SYNB1934 mit SYN1618 zu vergleichen. An jedem der Versuchstage erhielten sechs NHP-Probanden eine Dosis SYNB1618 oder SYNB1934 und die oben dargestellten Daten sind die kombinierten Ergebnisse von drei Experimenten.

Die Tiere wurden über Nacht am Tag vor der Dosierung (Tag 1) und während des gesamten Verfahrens am Tag 1 nicht länger als maximal 24 Stunden gefüttert. Am Morgen des ersten Tages wurde jedem Affen durch Venenpunktion eine Basisblutprobe entnommen. Die Tiere wurden für die Dosisverabreichung vorübergehend festgehalten, jedoch nicht sediert. Lyophilisierte Bakterien wurden resuspendiert und jedem Tier zusammen mit 5 ml 0,36 M Natriumbicarbonat und 7,7 ml 20 mg/ml L-Phenyl-D5-Alanin (C/D/N Isotopes Inc.) eine Dosis von 1011 Lebendzellen oral verabreicht. und 6,1 ml 500 g/L Peptone Peptic Digest (Sigma). Zur weiteren Analyse wurden Plasma und kumulativer Urin gesammelt. Nach der Dosierung wurden die Tiere in ihre Käfige zurückgebracht und eine saubere Urinsammelschale wurde auf den Boden jedes Käfigs gestellt. Insgesamt wurde 6 Stunden nach der ersten Dosierung das kumulative Urinvolumen gemessen und aufgezeichnet, und die Urinproben wurden bei –80 °C gelagert. Blutproben wurden 0,5, 1, 2, 4 und 6 Stunden nach der Verabreichung entnommen und das Plasma wurde hergestellt und bei –80 °C eingefroren. Die Konzentrationen der Metaboliten wurden mithilfe eines Derivatisierungstests mit LC-MS/MS-Detektion quantifiziert.

Die Quantifizierung von TCA, d5-TCA, HA und d5-HA wurde unter Verwendung des MRM-Modus (Targeted Multiple Reaction Monitoring) in einem Thermo TSQ Quantum Max Triple-Quadrupol-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometriesystem (LC-MS/MS) durchgeführt. Die verwendeten Standards waren trans-Zimtsäure (Acros, 158570050), trans-Zimtsäure-d5 (CDN Isotopes, D-5284), Hippursäure (Sigma, 112003) und Hippursäure-d5 (CDN Isotopes, D-5588). .

Standards wurden in Wasser mit den folgenden Konzentrationen hergestellt: 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20, 100 und 250 μg/ml. Die Proben wurden vor der Analyse bei –80 °C gelagert. Urinproben wurden vor der Probenverarbeitung 40-fach in Wasser verdünnt. Kreatinin (Sigma, 60275) wurde der Standardmischung bei der Analyse von HA und d5-HA im Urin zugesetzt (0,32, 1,6, 8, 40, 200, 1000 und 2500 μg/ml). In eine 96-Well-Platte wurden 10 µL der Standards und Proben übertragen, gefolgt von der Zugabe von 90 µL Derivatisierungslösung (50 mM 2-Hydrazinochinolin, Dipyridyldisulfid und Triphenylphosphin in Acetonitril mit 1 µg/ml isotopenmarkierter interner Lösung). Standard 13C9-15N-Phe (Cambridge Isotopes, CNLM-575-H-PK) und d5-Kreatinin (CDN Isotopes, D-7707). Die Platte wurde mit einer ThermASeal-Folie heißversiegelt, gemischt und bei 60 °C inkubiert 1 Stunde lang, um die Proben zu derivatisieren. Die derivatisierten Proben wurden dann 5 Minuten lang bei 3200 × g zentrifugiert. Auf eine andere Platte wurden 20 µL der derivatisierten Proben übertragen und mit 180 µL 0,1 % Ameisensäure in Wasser/Acetonitril weiter verdünnt ( 140:40). Das verwendete Injektionsvolumen betrug 10 µL und die Laufzeit betrug 4,25 m bei einer Flussrate von 0,5 ml/Minute. Die mobile Phase A bestand aus 0,1 % Ameisensäure im Wasser und die mobile Phase B aus 0,1 % Ameisensäure Säure in Acetonitril/Isopropanol (90:10). Die chromatographische Trennung erfolgte unter Verwendung einer Phenomenex C18-Säule (3 µm, 100 × 2 mm) mit folgendem Gradienten: 10 % B von 0 bis 0,5 m, 10 bis 97 % B von 0,5 bis 2 m, 97 % B von 2 bis 4 m und 10 % B von 4 bis 4,25 m. Für die Tandem-Massenspektrometrieanalyse wurde die Mehrfachreaktionsüberwachung im Positivmodus verwendet. Die folgenden Massenübergänge wurden zur Quantifizierung überwacht: TCA (290/131), d5-TCA (295/136), HA (321/160), d5-HA (326/160) und Kreatinin (114/44).

Gruppenmittelwerte, Standardfehler/-abweichungen und lineare Regressionen wurden in Microsoft Excel berechnet. Zur Berechnung der p-Werte wurden in Graphpad Prism oder in Excel ungepaarte Schüler-t-Tests, einfaktorielle ANOVA gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstests oder Welchs ANOVA mit Dunnetts T3-Mehrfachvergleichstests durchgeführt. Die Flächen unter der Kurve wurden mit der linear-trapezförmigen Methode unter Verwendung von Graphpad Prism berechnet und die Basislinien wurden durch die Durchschnittswerte zum Zeitpunkt 0 für jedes anwendbare Experiment festgelegt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und den begleitenden ergänzenden Informationsdateien) enthalten. Durchflusszytometriedaten (Abb. 1b) werden als .fcs-Dateien im komprimierten Ordner „Fig1b_fcs_files“ in den Quelldaten bereitgestellt. Alle weiteren Daten werden in der Datei „Source data.xlsx“ bereitgestellt. Der E. coli Nissle-Stamm 1917 wurde von DSMZ erhalten und für die Konstruktion manipulierter Stämme verwendet, die zur Erzeugung von SYNB1618 und SYNB1934 führten. Alle in diesem Manuskript beschriebenen Stämme stammen aus demselben elterlichen Hintergrund. Die in diesem Manuskript beschriebenen gentechnisch veränderten Stämme können vorbehaltlich einer MTA zur Verfügung gestellt werden, die bei den entsprechenden Autoren angefordert werden kann. Die vollständige Genomsequenz von SYNB1618 ist unter BioProject ID: PRJNA482064 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA482064) verfügbar. Die vollständige Genomsequenz von SYNB1934 ist unter der BioProject ID: PRJNA749270 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA749270) verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Die Autoren danken Caitlin Allen, Mark Charbonneau, Caroline Kurtz und Dave Hava für ihr Feedback während dieses Projekts und während der Erstellung dieses Manuskripts.

Per Jr. Die Reise

Aktuelle Adresse: Novo Nordisk Research Center Seattle Inc, 530 Fairview Ave N, Seattle, WA, 98109, USA

Lindong Weng

Aktuelle Adresse: Sana Biotechnology, 1 Tower Place Suite 500, South San Francisco, CA, 94080, USA

Zymergen Inc. (ehemals enEvolv Inc.), 100 Acorn Park Drive, Cambridge, MA, 02140, USA

Kristin J. Adolfsen, Isolde Callihan, Per Jr. Greisen, James Spoonamore, Lauren E. Fitch, Lindong Weng, Carl J. Weile, Jay H. Konieczka und Adam G. Lawrence

Synlogic Inc, 301 Binney St, Cambridge, MA, 02139, USA

Catherine E. Monahan, Munira Momin, Mary Joan Castillo, Lauren Renaud, Teodelinda Mirabella, Andres Abin-Fuentes und Vincent M. Isabella

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KJA, AGL, VMI und AA betreuten das Projekt. KJA, IC, VMI und AA analysierten die Daten. JS führte die Sensorerkennung durch. PG überwachte das Enzym-Engineering und lieferte alle PAL-Designempfehlungen. LEF entwarf rechnerisch die notwendigen Primer, um die Mutationen einzuführen, und die kombinatorische PAL-Bibliothek wurde von KJA konstruiert. Das sensorbasierte Screening wurde von KJA, LW und IC durchgeführt. Plattenbasierte aktivierte Biomasse-Assays und Variantensequenzierung wurden von KJA, IC und CWLEF durchgeführt führte die Generierung von PyMOL-Figuren durch. AGL, PG, JS und JHK sorgten für die Aufsicht. CM war für die Konstruktion der Kandidatenstämme und die Durchführung/Analyse von In-vitro-Experimenten verantwortlich. AA und MM waren für die Fermentation und Formulierung der Stämme verantwortlich. MJC führte eine massenspektroskopische Analyse durch und analysierte sie. TM und LR überwachten die Durchführung von NHP-Studien.

Korrespondenz mit Vincent M. Isabella.

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden Interessen: Alle Autoren halten Aktien von Synlogic, Inc. oder Zymergen, Inc. und können durch die Veröffentlichung finanzielle Gewinne oder Verluste erzielen.

Informationen zum Peer-Review Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Adolfsen, KJ, Callihan, I., Monahan, CE et al. Verbesserung eines synthetischen lebenden Bakterientherapeutikums gegen Phenylketonurie durch biosensorgestützte Enzymtechnik. Nat Commun 12, 6215 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-26524-0

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Eingegangen: 14. Juni 2021

Angenommen: 12. Oktober 2021

Veröffentlicht: 28. Oktober 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-26524-0

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