Invadopodien ermöglichen eine kooperative Invasion und Metastasierung von Brustkrebszellen

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 758 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Bei der kooperativen Invasion können invasive und nicht-invasive Krebszellen gemeinsam eindringen. Die dazu führenden Ereignisse, die Rolle des epithelial-mesenchymalen Übergangs und die möglichen Folgen für die Metastasierung sind jedoch unbekannt. In dieser Studie zeigen wir, dass sich die isogenen 4T1- und 67NR-Brustkrebszellen in 3D-Sphäroiden voneinander trennen, gefolgt von einer kooperativen Invasion. Durch Zeitraffermikroskopie zeigen wir, dass sich die invasiven 4T1-Zellen im Vergleich zu nicht-invasiven 67NR-Zellen dauerhafter bewegen und sich an der Sphäroid-Matrix-Grenzfläche sortieren und ansammeln, ein Prozess, der von Zell-Matrix-Adhäsionen abhängt und unabhängig von E-Cadherin-Zelle-Zelle ist Verwachsungen. Die Eliminierung von Invadopodien in 4T1-Zellen blockiert die Invasion, was zeigt, dass der Bedarf an Invadopodien auf Leitzellen beschränkt ist. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass Zellen mit und ohne Invadopodien auch in präklinischen Mausmodellen an der kooperativen Metastasierung beteiligt sein können. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass eine kleine Anzahl von Zellen mit Invadopodien die Metastasierung heterogener Zellcluster vorantreiben kann.

Mehr als 90 % der Krebspatienten sterben an den Folgen von Metastasen, also dem Prozess der Ausbreitung, Neuaussaat und dem Wachstum von Krebszellen in sekundären Organen1,2. Bei Brustkrebs haben neuere Arbeiten gezeigt, dass Metastasen meist aus polyklonalen Aussaaten entstehen3,4. Diese polyklonalen Metastasen entstehen durch die kollektive Verbreitung von Zellclustern, im Gegensatz zur sukzessiven Anhäufung mehrerer einzelner Klone. Zusammen mit der wachsenden Literatur zur phänotypischen Heterogenität innerhalb von Primärtumoren5 legen diese Beobachtungen nahe, dass die Kooperativität zwischen Klonen von Krebszellen die Metastasierung erleichtern könnte.

Bei Brustkrebs wird die Metastasierungskaskade eingeleitet, wenn Krebszellen invasive Eigenschaften erlangen, zu denen die Integration von Motilität und die Fähigkeit zum Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) gehört2. Sowohl Invasion als auch Motilität sind häufig mit der Aktivierung des epithelial-mesenchymalen Übergangsprogramms (EMT) verbunden6. Während der EMT verlieren Epithelzellen allmählich den Zell-Zell-Kontakt, verstärken zunehmend ihre Adhäsionen an der ECM und erhöhen ihre Kontraktilität, wodurch sie beweglich werden. Begleitend zur EMT können Krebszellen auch die Fähigkeit erwerben, die ECM mithilfe von Invadopodien lokal abzubauen7,8,9,10. Invadopodien sind Membranvorsprünge, die mit Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) angereichert sind und Krebszellen eine hohe proteolytische Aktivität11,12 und, was wichtig ist, ein erhöhtes Metastasierungspotential verleihen13,14. Da es sich beim EMT-Programm weder um einen binären noch um einen unidirektionalen Schalter handelt und es mehrere EMT-Routen gibt, können unterschiedliche EMT-Trajektorien zu Krebsklonen mit unterschiedlichem Grad der Invasivität führen15.

Jüngste 3D-In-vitro-Studien zu Brustkrebs zeigten, dass invasive Kollektivstränge aus Krebszellen bestehen, die sich in mehreren invasiven Merkmalen unterscheiden3,16,17,18,19,20. Beispielsweise zeigen Leaderzellen im Vergleich zu Followerzellen eine erhöhte Kontraktilität19, Zell-ECM-Adhäsion3,16, ECM-Umbau20 und ECM-Abbaukapazitäten18,19. Dadurch können Leaderzellen die Invasion ansonsten nicht-invasiver Followerzellen ermöglichen, ein Phänomen, das als kooperative Invasion bezeichnet wird21. Unsere jüngsten Arbeiten haben gezeigt, dass sich Leaderzellen größtenteils in der G1-Phase des Zellzyklus befinden, der Phase des Zellzyklus, in der der durch Invadopodien vermittelte ECM-Abbau am höchsten ist22. Diese Daten deuten darauf hin, dass während der kollektiven Invasion die Leitzellen vorzugsweise Invadopodien versammeln. Obwohl für eine kollektive Invasion eindeutig ein Abbau der ECM erforderlich ist, ist die Rolle des durch Invadopodien vermittelten ECM-Abbaus in Leader- und Follower-Zellen unklar. Bisher wurde in keiner der Studien die räumliche Neuordnung detailliert beschrieben, die der kooperativen Invasion vorausgehen könnte. Da alle früheren Studien die kooperative Invasion in 3D-Kulturen untersuchten, wurde die Zusammenarbeit bei der Verbreitung und Metastasierung noch nicht untersucht.

In dieser Studie wollen wir verstehen, wie Krebsklone mit unterschiedlichen invasiven Fähigkeiten bei Invasion und Metastasierung zusammenarbeiten können. Wir zeigen, dass invasive Klone von nicht-invasiven Klonen trennen und diese zu einer kooperativen Invasion und Metastasierung führen können. Unsere Studie legt nahe, dass die Kooperativität zwischen Krebszellen ein effizienter Mechanismus für die kollektive Metastasierung sein könnte.

Um zu untersuchen, wie Krebsklone mit unterschiedlichen invasiven Fähigkeiten während der Metastasierung zusammenarbeiten, verwendeten wir das isogene Paar der Brustkrebszelllinien 4T1 und 67NR, syngen für Balb/C-Mäuse23,24. Bei der orthotopen Implantation bilden beide Zelllinien Primärtumoren, aber nur 4T1-Zellen metastasieren25. Wir haben die invasiven Kapazitäten von 4T1- und 67NR-Zellen im Sphäroidinvasionstest im hochdichten Kollagen I untersucht, der einen MMP-gesteuerten Abbau der Matrix erfordert22. Nach zwei Tagen stellten wir fest, dass die 4T1-Zellen eine starke Invasion in die Kollagen-I-Matrix zeigten, während 67NR-Zellen nicht eindrangen (Abb. 1a, b). Die Behandlung mit dem Pan-MMP-Inhibitor GM6001 blockierte wirksam die Invasion von 4T1-Zellen (Abb. 1a, b). Darüber hinaus zeigte die Immunfluoreszenzmarkierung von MMP-vermittelten Kollagen-I-Spaltungsstellen (Col ¾), dass die Invasion von 4T1-Zellen in die Matrix MMP-abhängig war (Abb. 1c). Die Behandlung mit Mitomycin C, das die Zellteilung beeinträchtigt26, bestätigte, dass die Invasion von 4T1-Zellen nicht auf Zellproliferation zurückzuführen war (Abb. 1a, b und S1). Es ist bekannt, dass 4T1-Zellen als kollektive Stränge eindringen, wobei E-Cadherin an Zell-Zell-Verbindungen vorhanden ist27,28. Wir haben bestätigt, dass 4T1-Zellen E-Cadherin exprimierten, während 67NR-Zellen N-Cadherin exprimierten (Abb. S2a, b)27,28,29. Sowohl die 4T1- als auch die 67NR-Zelllinie exprimierten Vimentin (Abb. S2a). Interessanterweise werden auf der EMT-Achse (phänotypisches Kontinuum von epithelial zu mesenchymal) die invasiven 4T1-Zellen als epithelial/mesenchymal und die nicht-invasiven 67NR-Zellen als mesenchymal klassifiziert. Darüber hinaus fanden wir in den 4T1-Sphäroiden eine Anreicherung von E-Cadherin an allen Zell-Zell-Übergängen, nämlich zwischen Leader- und Follower-Zellen sowie zwischen Follower- und Follower-Zellen. Dies bestätigte, dass die Integrität der E-Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Verbindungen während der Invasion erhalten blieb (Abb. S2c, d)30. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass 4T1-Zellen eine MMP-abhängige kollektive Invasion durchführen, während die 67NR-Zellen nicht in die dichte Kollagen-I-Matrix eindringen.

a Sphäroide aus 4T1- und 67NR-Zellen am Tag 0 und Tag 2 nach der Einbettung in eine 3D-Kollagen-I-Matrix. Kerne wurden mit DAPI gefärbt. Sphäroide wurden ab Tag 0 mit einem Pan-MMP-Inhibitor (GM6001, Bild oben rechts), einem Zellzyklusinhibitor (Mitomycin C, Mito C, Bild unten rechts) oder einer DMSO-Kontrolle (Bild links) behandelt. Maßstabsbalken: 100 µm. b Sphäroidfläche als Funktion der Zeit für 4T1- und 67NR-Zellen aus (a). P = 5,81 × 10−4 und 1,23 × 10−4, nach dem t-Test. c Eindringender Strang eines 4T1-Sphäroids, Tag 2 nach der Einbettung, immunmarkiert für MMP-gespaltenes Kollagen I (Col-3/4, grün) und gefärbt für F-Aktin (Phalloidin, Magenta) und Kerne (DAPI, blau). Maßstabsbalken: 50 µm. d Western Blot der Tks5- und Cortactin-Expression in 4T1- und 67NR-Zellen. β-Aktin wird als Ladungskontrolle verwendet. e Gelatineabbau für 4T1-Zellen (oberes Feld) und 67NR-Zellen (unteres Feld) 18 Stunden nach der Plattierung. Die Einschübe zeigen eine 4-fache Vergrößerung des umrahmten Bereichs und Pfeilspitzen zeigen repräsentative Abbaulöcher an. Maßstabsbalken: 20 µm. Siehe Abb. S3a für F-Aktin. f Abbaubereich für 4T1- und 67NR-Zellen aus (e). P < 4,40 × 10−16, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. g 4T1-Zellen, kultiviert auf fluoreszierender Gelatine (grau), markiert für Tks5 (grün) und F-Aktin (Phalloidin, Magenta). Die Einschübe zeigen eine 2-fache Vergrößerung des umrahmten Bereichs und Pfeilspitzen zeigen repräsentative funktionelle Invadopodien an. Maßstabsleiste: 10 µm. h 4T1-Strang am Tag 2 Tage nach der Einbettung, markiert für Tks5 (grün), gespaltenes Kollagen (cyan), F-Aktin (magenta) und Kerne (blau). Die Einfügungen zeigen eine 1,25-fache Vergrößerung des umrahmten Bereichs. Maßstabsbalken: 30 µm. i 4T1- (links) und 67NR-Monoschichten (rechts) 24 Stunden nach der Verletzung. Es werden repräsentative Zelltrajektorien angezeigt. Siehe Film S1. Maßstabsbalken: 100 µm. j Trajektorien von 4T1-Zellen (oben) und 67NR-Zellen (unten) aus dem Wundtest in (i), dargestellt als Windrosendiagramme, die zu einem gemeinsamen Ursprung verschoben sind. k Momentane Geschwindigkeit von 4T1- und 67NR-Zellen aus (j). P = 1,17 × 10−13, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. l Persistenz (Nettoverschiebung/Pfadlänge) von 4T1- und 67NR-Zellen aus (j). P < 2,20 × 10−16, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. Unbeschnittene Western Blots sind in der ergänzenden Abbildung S13 verfügbar.

Invadopodien sind Membranvorsprünge, die mit Aktin, Aktin-bindenden Proteinen wie Cortactin und Tks5 sowie MMPs angereichert sind11,12. Da die Funktion von Invadopodien zu einem lokalen ECM-Abbau führt, stellten wir die Hypothese auf, dass Invadopodien eine Rolle bei der Invasion von 4T1-Zellen spielen. Wir kamen auch zu dem Schluss, dass der beobachtete Unterschied in der Invasionskapazität von 4T1- und 67NR-Zellen zumindest teilweise durch eine Ungleichheit in ihrer Invadopodienfunktion erklärt werden könnte. Um dies zu testen, haben wir zunächst das Expressionsniveau der wichtigsten Invadopodia-Komponenten Cortactin und Tks511 analysiert. Beide Zelllinien exprimierten ähnliche Cortactin- und Tks5-Spiegel (Abb. 1d). Als nächstes haben wir die Invadopodienfunktion gemessen, indem wir Zellen auf fluoreszierend markierter Gelatine kultiviert haben, was die Visualisierung des Abbaus als Löcher in der Matrix ermöglicht31. Wir fanden heraus, dass 4T1-Zellen, aber nicht 67NR-Zellen, in der Lage waren, die Gelatineschicht abzubauen (Abb. 1e, f). In 4T1-Zellen waren Punkte aus co-lokalisiertem Tks5, F-Actin und abgebauter Gelatine vorhanden, die auf funktionelle und reife Invadopodien hinweisen (Abb. 1g). Dies legt nahe, dass die beobachteten Abbaulöcher durch Invadopodien erzeugt wurden. Puncta aus kolokalisiertem Tks5 und F-Actin, die auf Invadopodia-Vorläufer hinweisen, waren sowohl in 4T1- als auch in 67NR-Zellen in ähnlichen Mengen vorhanden (Abb. S3a, b). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Invadopodia-Vorläufer in 67NR-Zellen nicht reifen. Um zu untersuchen, ob Invadopodien auch bei der Invasion von 4T1-Zellen in Sphäroiden eine Rolle spielen, haben wir Sphäroide für F-Actin-, Tks5- und MMP-vermittelte Kollagen-I-Spaltungsstellen markiert. Wir identifizierten funktionelle Invadopodien in Leitzellen, was durch die gleichzeitige Lokalisierung von F-Actin-, Tks5- und MMP-vermittelten Kollagen-I-Spaltungsstellen nachgewiesen wurde (Abb. 1h). Diese Beobachtungen stellten einen Zusammenhang zwischen Invadopodien und der kollektiven Invasion von 4T1-Zellen her und legen nahe, dass Leitzellen Invadopodien zusammenbauen.

Da der Invasionsphänotyp aus Invadopodia-vermitteltem ECM-Abbau und Zellmigration besteht32, führten wir einen Scratch-Assay durch, um zu untersuchen, ob 67NR-Zellen genauso effizient migrieren können wie 4T1-Zellen. Wir haben einzelne Zellen verfolgt (Abb. 1i, j und Film S1) und festgestellt, dass die Momentangeschwindigkeit von 67NR-Zellen zwar höher ist als die von 4T1-Zellen (Abb. 1k), 4T1-Zellen jedoch deutlich beständiger sind als 67NR-Zellen (Abb. 1l). ).

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass das 4T1/67NR-Paar ein geeignetes Werkzeug ist, um zu untersuchen, wie Krebsklone mit unterschiedlichen invasiven Kapazitäten während der Invasion zusammenarbeiten.

Als nächstes wollten wir die Dynamik der räumlichen Organisation und Invasion in den Sphäroiden untersuchen, in denen 4T1 und 67NR vermischt sind. Wir haben 4T1-mScarlet- und 67NR-GFP-Zelllinien erzeugt und diese im Verhältnis 1:50 gemischt, um die höhere Proliferationsrate von 4T1 im Verlauf des Sphäroidinvasionstests zu berücksichtigen (Abb. S4a, b). Als nächstes betteten wir die gemischten Sphäroide in Kollagen I ein und führten täglich eine Längsschnittbildgebung durch (Abb. 2a und S4c)33. Wir stellten fest, dass sich 67NR- und 4T1-Zellen ab Tag 3 voneinander trennten. Einzelne optische Schnitte (Film S2) und die Analyse der Zellkoordinaten zeigten deutlich die Anreicherung von 4T1-Zellen am Rand von Sphäroiden (Abb. 2b und S4d). Um die Zellsortierung zu quantifizieren, haben wir den relativen Abstand jeder Zelle zum Sphäroidzentrum berechnet, eine Metrik, die wir Distance Index (DI) nannten, sodass ein Wert von 0 eine Zelle im Sphäroidzentrum markiert und ein Wert von 1 einer Zelle entspricht an der Sphäroid-Kollagen-I-Grenzfläche (Abb. 2c). Am dritten Tag nach der Einbettung stellten wir fest, dass der DI von 4T1-Zellen mit der Zeit zunahm und deutlich höher war als der DI von 67NR-Zellen (Abb. 2d). Dieser Trend war auch bei einzelnen Sphäroiden vorhanden (Abb. S4e). Diese Daten zeigten, dass sich die Zellen im Laufe von drei Tagen von einer zufälligen Verteilung zu Sphäroiden umorganisierten, wobei 4T1-Zellen die Grenzfläche bevölkerten und 67NR-Zellen im Sphäroidkern lokalisiert waren. An den Tagen 4–6 folgte auf die Zellsortierung der 4T1- und 67NR-Zellen die Invasion (Abb. S4f).

a Gemischtes Sphäroid mit einem Verhältnis von 4T1-mScarlet (magenta) zu 67NR-GFP (grün) Zellen im Verhältnis 1:50, eingebettet in 3D-Kollagen I und täglich abgebildet. Tag 1 gibt den Tag 1 nach der Einbettung an. Siehe Film S2. Maßstabsbalken: 100 µm. b Koordinaten von 4T1-mScarlet- (4T1-mScar, Magenta) und 67NR-GFP-Zellen (grün) aus allen in (a) und Abb. S3c dargestellten Sphäroiden. c Schematische Darstellung des Distanzindex (DI); a und b stellen die großen/kleinen Halbachsen des Sphäroids dar und d stellt den Abstand zwischen der Sphäroidmitte und einer Zelle dar. DI ist d/a, der relative Abstand jeder Zelle zum Sphäroidzentrum, siehe Materialien und Methoden. d DI für 4T1-mScarlet- (Magenta) und 67NR-GFP-Zellen (grüne Kästchen) aus Sphäroiden in (a, b). P = 1,32 × 10−14 und <2,20 × 10−16, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. e Gemischte Sphäroide am 3. und 4. Tag nach der Einbettung. Sphäroide wurden ab Tag 0 mit einem Inhibitor der Zellkontraktilität (ROCK-Inhibitor, Y-27632, obere Bilder) oder einem Pan-MMP-Inhibitor (GM6001, untere Bilder) behandelt. Maßstabsbalken: 100 µm. f DI für 4T1-mScarlet (magenta) und 67NR-GFP (grün) Zellen aus Sphäroiden in (e). g Schematische Darstellung der Rand- (dunkelgrau) und Kernkompartimente (hellgrau) in einem Sphäroid. h Schnappschüsse eines gemischten Sphäroids, aufgenommen am Anfang (Tag 0,5, 10 Stunden nach der Einbettung) und am Ende der Zeitrafferaufnahme (Tag 2,5, 54 Stunden nach der Einbettung). Für 4T1-mScarlet- und 67NR-GFP-Zellen werden repräsentative Zelltrajektorien in den Rand- und Kernkompartimenten, farblich nach Zeit kodiert, angezeigt (rechte Tafel). Maßstabsbalken: 100 µm. i Δ Distance Index (ΔDI) für 4T1-mScarlet (magenta) und 67NR-GFP (grün) Zellen aus Sphäroiden in (h). Siehe auch Filme S3–6. Ein positiver ΔDI zeigt die Zellmotilität in Richtung der Sphäroidkante („Out“) an, und ein negativer ΔDI zeigt eine Bewegung in Richtung der Sphäroidmitte („In“) an. Sphäroide wurden ab Tag 0 mit DMSO-Kontrolle (links) oder GM6001 (rechts) behandelt. P = 0,0204, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. j Mittlere quadratische Verschiebungen (MSDs) für 4T1-mScarlet- (Magenta) und 67NR-GFP-Zellen (grün) aus Sphäroiden in (h). MSDs wurden in der radialen (links) und Winkelrichtung (rechts) des Polarkoordinatensystems für Randzellen (durchgezogene Linien) und Kernzellen (gestrichelte Linien) in Sphäroiden berechnet, die mit DMSO (oben) bzw. GM6001 (unten) behandelt wurden. Die Diagramme werden im Log-Log-Maßstab dargestellt und verdeutlichen die superdiffusive (α > 1), diffusive (α = 1) und subdiffusive (α < 1) Natur der Motilität. Durchgezogene Linien dienen als Orientierung für das Auge und geben die durchschnittlichen Steigungen (α-Werte) an, die diesen verschiedenen Motilitätsmodalitäten entsprechen. k Potenzgesetz-Exponent αr ist (links) für 4T1-mScarlet- (Magenta) und 67NR-GFP-Zellen (grün) aus Rand- und Kernkompartimenten in einem Sphäroid dargestellt. Der effektive Diffusionskoeffizient in radialer Richtung wird für die DMSO-Kontrolle (oben rechts) oder GM6001 (unten rechts) aus Rand- und Kernkompartimenten in einem Sphäroid angezeigt.

Sphäroide von 4T1-Zellen enthalten nachweislich Laminin, Kollagen I und Fibronektin im extrazellulären Raum34. Das Vorhandensein von ECM in einem Sphäroid lässt darauf schließen, dass die 3D-Zellmotilität und folglich die Zellsortierung MMPs erfordern könnten. Um den Zusammenhang zwischen Motilität, MMPs und Zellsortierung zu testen, behandelten wir Sphäroide mit einem Inhibitor der Zellkontraktilität (ROCK-Inhibitor, Y-27632) oder einem Pan-MMP-Inhibitor, GM6001. Wir fanden heraus, dass beide Behandlungen die Zellsortierung blockierten (Abb. 2e, f). Anschließend führten wir Zeitrafferaufnahmen gemischter Sphäroide durch. Wir haben einzelne Zellen innerhalb des Sphäroids verfolgt (Abb. 2h und Filme S3, 4) und für jede Zelle die Differenz zwischen dem anfänglichen und dem endgültigen Abstandsindex berechnet (ΔDI = DI für die letzte Position einer bestimmten Zelle – DI für die Anfangsposition). einer gegebenen Zelle), so dass ein positiver ΔDI die Zellmotilität in Richtung des Sphäroidrandes („out“ in Abb. 2g, i) anzeigt und ein negativer ΔDI eine Bewegung in Richtung des Sphäroidzentrums („in“ in Abb. 2g, i) anzeigt ). Ein Null-ΔDI zeigt keine Nettobewegung an. Wir klassifizierten jede Zelle erneut anhand ihrer Ausgangsposition als Rand oder Kern und definierten das Randkompartiment als eine zweizellige Schicht, die der Sphäroid-Kollagen-Grenzfläche am nächsten liegt (30 µm breiter elliptischer Ring; Abb. 2g). Wir fanden heraus, dass der Prozentsatz der verfolgten Zellen, die während der Dauer der Zeitrafferbildgebung zwischen den Kompartimenten wechselten, für alle Zellen vernachlässigbar war, mit Ausnahme der 4T1-Zellen, die sich ursprünglich im Kern befanden (Abb. S5a). Bei 4T1-Zellen stellten wir fest, dass der ΔDI bei Zellen, deren Ausgangsposition im Sphäroidkern lag, signifikant höher war als bei Zellen, deren Ausgangsposition am Sphäroidrand lag (Abb. 2h, i). Dies weist darauf hin, dass sich 4T1-Zellen vom Sphäroidkern zum Sphäroidrand bewegt haben. Im Gegensatz dazu hatten 4T1-Zellen, die sich am Rand des Sphäroids befanden, einen ΔDI nahe Null, was darauf hindeutet, dass sich 4T1-Zellen, die sich ursprünglich am Rand des Sphäroids befanden, nur innerhalb dieses Kompartiments bewegten (Abb. 2i). Die ΔDIs waren für alle 67NR-Zellen unabhängig von ihrer ursprünglichen Position minimal, was darauf hindeutet, dass sich diese Zellen nur innerhalb der Kompartimente bewegten, in denen sie sich ursprünglich befanden (Abb. 2i). Da ΔDI die Anfangs- und Endpositionen von Zellen vergleicht, liefert diese Metrik keine Informationen über die Persistenz von Zellen. Tatsächlich kann die Zellbahn für einen gegebenen ΔDI mehr oder weniger gewunden sein. Durch die Berechnung der mittleren quadratischen Verschiebung (MSD) von Zellen im Polarkoordinatensystem, das die Sphäroidsymmetrie erfasst, haben wir festgestellt, dass 4T1-Zellen in radialer Richtung beständiger sind (superdiffusiv, α > 1) als 67NR-Zellen (diffusiv, α). = 1) (Abb. 2j, k und S5b–d). Sowohl 4T1- als auch 67NR-Zellen zeigten ein ähnliches Motilitätsverhalten in Winkelrichtung (Abb. 2j und S5b, c). Die Behandlung von Sphäroiden mit GM6001 beeinträchtigte die Bewegung von 4T1-Zellen vom Kern zum Rand (Abb. 2i–k, Filme S5, 6) und führte zu einem verringerten effektiven Diffusionskoeffizienten aller Zellen in radialer Richtung (Abb. 2j, k und S5b–d). Wir haben bestätigt, dass das Sphäroidwachstum unter GM6001- und DMSO-Bedingungen ähnlich war, was darauf hindeutet, dass der Verlust der Zellsortierung unabhängig von der Zellproliferation war (Abb. S5e). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Zellsortierung innerhalb gemischter Sphäroide hauptsächlich durch die gerichtete Beweglichkeit der 4T1-Zellen vom Kern zum Randkompartiment und ihre Fähigkeit, am Rand zu bleiben, gesteuert wird, während 67NR-Zellen eine zufällige (diffusive) Beweglichkeit zeigen und darin verbleiben das gleiche Fach im Laufe der Zeit. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass Unterschiede in der Persistenz die Zellsortierung zwischen 4T1- und 67NR-Zellen beeinflussen.

Während die Selbstorganisation und Strukturierung von Zellen in embryonalen Geweben und während der Entwicklung intensiv untersucht wird, wurden bisher nur wenige Studien Mischungen aus zwei oder mehr Zelltypen im Krebs-Sphäroidmodell getestet19,20. In den meisten Studien wurde berichtet, dass Zellen auf der Grundlage der Differentialadhäsionshypothese sortiert werden, die eine Sortierung basierend auf Unterschieden in der interzellulären Adhäsion vorhersagt, wobei Zellen, die die stärksten Zell-Zell-Adhäsionen aufweisen, in der Mitte positioniert sind35. Basierend auf der Expression von Cadherinen für das 4T1/67NR-Paar sagt die Differentialadhäsionshypothese voraus, dass sich in einem 3D-Sphäroid E-Cadherin-exprimierendes 4T1 von N-Cadherin-exprimierenden 67NR-Zellen trennt, wobei sich 4T1-Zellen in der Mitte und 67NR befinden Zellen, die sie umgeben. Im Gegensatz dazu zeigen unsere Daten das entgegengesetzte Muster (Abb. 2a, b), was darauf hindeutet, dass die Hypothese der unterschiedlichen Adhäsion in unserem Modell möglicherweise nicht zutrifft. Um dies zu bestätigen, haben wir Zell-Zell-Verbindungen in 4T1-Zellen über einen E-Cadherin-blockierenden Antikörper gehemmt (Abb. 3a). Interessanterweise wurde durch die Blockierung von E-Cadherin die Zellsortierung zwischen 4T1- und 67NR-Zellen nicht beseitigt, sondern um einen Tag verzögert (Abb. 3b). Um dieses Ergebnis zu bestätigen, haben wir stabile E-Cadherin-Knockdown-Zelllinien generiert (Ecad-KD1 und Ecad-KD2; Abb. 3c – e). Laut Western-Blot-Analyse betrug die Abnahme der E-Cadherin-Expression 36,3 % für Ecad-KD1 und 96,8 % für Ecad-KD2. Beide Ecad-KD-Zelllinien wurden aus den 67NR-GFP-Zellen aussortiert und akkumulierten am dritten Tag nach dem Einbetten bis zum Sphäroidrand (Abb. 3g, h). Insgesamt deutet dies darauf hin, dass die Zellsortierung in unserem Modell unabhängig von E-Cadherin ist.

a Gemischte Sphäroide im Verhältnis 1:50, abgebildet am Tag 4 nach der Einbettung. Sphäroide wurden mit (+Ab, rechtes Feld) oder ohne (−Ab, linkes Feld) eines E-Cadherin-blockierenden Antikörpers behandelt. Maßstabsbalken: 100 µm. b DI für 4T1-mScar-Zellen (magentafarbene Kästchen) und 67NR-GFP-Zellen (grüne Kästchen) aus Sphäroiden in (a). P = 2,78 × 10−5, <2,2 × 10−16 bzw. 1,12 × 10−12, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. c Ecad-CTL-, Ecad-KD1- und -KD2-Zellen in 2D. Dargestellt sind E-Cadherin (grün, untere Felder) und Kerne (grau, obere Felder). d Integrierte Dichte des E-Cadherin-Signals von Zellen in (c). P = 4,85 × 10−12 und <2,2 × 10−16, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. e Western-Blot der E-Cadherin-Expression in Ecad-CTL-, -KD1- und -KD2-Zellen. β-Aktin wird als Ladungskontrolle verwendet. f Anzahl der Stränge pro Sphäroid (schwarz) und Anzahl der Einzelzellen pro Sphäroid (blau) für Ecad-CTL-, -KD1- oder -KD2-Sphäroide. Die roten leeren Symbole zeigen Nullwerte an. P = 9,01 × 10−10, 1,06 × 10−3 und 1,74 × 10−5, nach dem t-Test. g Gemischte Sphäroide im Verhältnis 1:50, abgebildet am Tag 4 nach der Einbettung. Es wurden Ecad-CTL-, -KD1- oder -KD2-Zellen verwendet. Maßstabsbalken: 100 μm. h DI für Ecad-CTL-, -KD1- und -KD2- (magentafarbene Kästchen) und 67NR-GFP-Zellen (grüne Kästchen) aus Sphäroiden in (g). P = 4,72 × 10−5, <2,20 × 10−16, 2,21 × 10−5, 2,12 × 10−15, 2,05 × 10−13 und <2,20 × 10−16, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. Unbeschnittene Western Blots sind in den ergänzenden Abbildungen verfügbar. S14–S15.

Da die Zellsortierung am dritten Tag nach der Einbettung erfolgte (Abb. 2a, d) und die Ansammlung von 4T1-Zellen am Sphäroidrand während der gesamten 3D-Invasion aufrechterhalten wurde (Abb. 2i), schlussfolgerten wir, dass die Wechselwirkung von 4T1-Zellen mit der ECM kann für die Aufrechterhaltung der Zellsortierung von entscheidender Bedeutung sein. Um dies zu testen, platzierten wir gemischte Sphäroide in einer nicht haftenden Matrix aus Agarose. An Tag 3 und 4 war der DI sowohl für 4T1-Zellen als auch für 67NR-Zellen ähnlich, was zeigt, dass in Agarose eingebettete Zellen nicht sortiert wurden (Abb. 4a, b). Die Fläche des Sphäroidkerns war sowohl in Kollagen I- als auch in Agarose-Matrizen ähnlich, was darauf hindeutet, dass der Verlust der Zellsortierung unabhängig von der Zellproliferation war (Abb. S6a). Dieses Fehlen einer Zellsortierung könnte darauf zurückzuführen sein, dass 4T1-Zellen ohne die adhäsive ECM nicht am Rand des Sphäroids verbleiben. Um dies in Echtzeit zu testen, führten wir eine Zeitrafferaufnahme gemischter Sphäroide durch, die in Agarose eingebettet waren, und verfolgten einzelne 4T1-Zellen (Abb. 4c; Film S7). Wir fanden heraus, dass der durchschnittliche ΔDI für Zellen, die sich ursprünglich im Randkompartiment befanden, negativ war und für Zellen, die sich ursprünglich im Kernkompartiment befanden, nahe Null lag (Abb. 4d). Dies weist darauf hin, dass sich 4T1-Zellen vom Sphäroidrandkompartiment in das Kernkompartiment (Film S8) und innerhalb des Kerns (Film S7) bewegen. Die 4T1-Zellen, die in das Randkompartiment eindringen, verlassen es anschließend, was bei in der Kollagen-I-Matrix eingebetteten Sphäroiden nicht beobachtet wurde (Film S9). Interessanterweise stellten wir bei der Berechnung der MSD von Zellen in radialer Richtung fest, dass der Unterschied in der Persistenz zwischen 4T1-Zellen (superdiffusiv, α > 1) und 67NR-Zellen (diffusiv, α = 1) erhalten blieb (Abb. 4e und S6b– d), was darauf hindeutet, dass für die Zellsortierung eine klebende ECM-Schnittstelle erforderlich ist.

a Gemischte Sphäroide in Agarosematrix, abgebildet am Tag 3 oder 4 nach der Einbettung. Maßstabsbalken: 100 µm. b DI für 4T1-mScarlet-Zellen (magentafarbene Kästchen) und 67NR-GFP-Zellen (grüne Kästchen) aus Sphäroiden in (a). c Schnappschüsse einer 44-stündigen Zeitrafferaufnahme eines gemischten Sphäroids, das in einer 3D-Kollagen-I-Matrix kultiviert wurde. Die Bilder wurden 10 Stunden (Tag 0,5) und 54 Stunden (Tag 2,5) nach dem Einbetten aufgenommen. Der Übersichtlichkeit halber sind nur 4T1-mScarlet-Zellen dargestellt. Repräsentative Zelltrajektorien, farblich nach Zeit kodiert, werden angezeigt (rechte Tafel). Siehe auch Filme S7–9. Maßstabsbalken: 100 µm. d ΔDI für 4T1-mScarlet-Zellen aus Sphäroiden in (c). P = 7,50 × 10−4, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. Der Potenzgesetz-Exponent αr ist für 4T1-mScarlet-Zellen (magentafarbene Balken) und 67NR-GFP-Zellen (grüne Balken) aus Rand- und Kernkompartimenten dargestellt. f Schema (links) des 2D-Zell-ECM-Konkurrenzassays und Vergrößerung der Zellen, die 24 Stunden nach der Beschichtung an der Gelatine/Poly-L-Lysin (PLL)-Grenzfläche vorhanden sind (oben, rechts). 4T1-mScarlet-Zellen (unten, linkes Feld) und 67NR-GFP-Zellen (unten, rechtes Feld) wurden nur auf den Gelatineinseln ausplattiert. Siehe auch Film S10. Maßstabsleiste: 200 µm. g Prozentsatz der 4T1-mScarlet-Zellen (magentafarbene Kästchen) und 67NR-GFP-Zellen (grüne Kästchen) auf Poly-L-Lysin (PLL) aus (f). h Schematische Darstellung des Kontaktwinkels (θ) (oben) und orthogonale xz-Ansichten von 4T1-mScarlet- und 67NR-GFP-Zellen auf Poly-L-Lysin (PLL) oder Gelatine, 5 Stunden nach der Beschichtung. Maßstabsbalken: 5 µm. i Kontaktwinkel θ für Zellen aus (h). PLL, 4T1 vs. 67NR: P = 1,25 × 10−9; 4T1, PLL vs. Gelatine: P = 4,13 × 10−10, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest.

Dies veranlasste uns zu der Hypothese, dass 4T1-Zellen im Vergleich zu 67NR-Zellen bevorzugt an der ECM haften. Um die Adhäsionseigenschaften von 4T1- und 67NR-Zellen mit ECM zu vergleichen, haben wir einen 2D-Zell-ECM-Adhäsiv-Konkurrenztest entwickelt, bei dem beide Zelltypen mit Poly-L-Lysin auf kreisförmigen Gelatineinseln (5,5 mm Durchmesser) ausplattiert wurden zwischen den Inseln vorhandener Belag (Abb. 4f). Nach 24 Stunden ermittelten wir die Anzahl der 4T1- und 67NR-Zellen, die von den Gelatineinseln in den mit Poly-L-Lysin beschichteten Bereich wanderten. Wir fanden heraus, dass 85 % der zum 24-Stunden-Zeitpunkt in der Poly-L-Lysin-Region vorhandenen Zellen 67NR-Zellen waren (Abb. 4g). Um dies zu erklären, analysierten wir die Zeitrafferfilme und stellten fest, dass in dem seltenen Fall, dass 4T1-Zellen von der Gelatine in den Poly-L-Lysin-Bereich übergingen, die Zellen schließlich zurück zur Gelatine wanderten (Film S10). Wir fragten uns, ob dies dadurch erklärt werden könnte, dass 4T1-Zellen eine höhere Adhäsionsstärke an Gelatine haben als 67NR-Zellen. Um dies zu testen, haben wir den Kontaktwinkel von auf Gelatine oder Poly-L-Lysin plattierten Zellen gemessen (Abb. 4h). Es wurde zuvor gezeigt, dass der Zell-Matrix-Kontaktwinkel mit der Adhäsionsstärke zunimmt36. Wir fanden heraus, dass beide Zelltypen einen ähnlichen Kontaktwinkel hatten, wenn sie auf Gelatine plattiert wurden (Abb. 4i). Auf Poly-L-Lysin plattierte 4T1-Zellen hatten jedoch einen deutlich geringeren Kontaktwinkel, während 67NR-Zellen sowohl auf Gelatine als auch auf Poly-L-Lysin ähnliche Kontaktwinkelwerte aufwiesen (Abb. 4i, was darauf hinweist, dass 4T1-Zellen im Vergleich zu 67NR-Zellen reagieren empfindlicher auf das Vorhandensein von ECM. Diese Affinität zu ECM steht im Einklang mit den höheren Konzentrationen von FAK und p-FAK, die in 4T1-Zellen beobachtet werden als in 67NR-Zellen (Abb. S6e). Durch die Analyse von Zell-Zell-Kontakten zwischen 4T1 und Bei auf Gelatine plattierten 67NR-Zellen stellten wir fest, dass der Prozentsatz homotypischer Kontakte zum Zeitpunkt der Plattierung (0 h) und 24 h nach der Plattierung ähnlich war (Abb. S6f, g). Dies bestätigte, dass 4T1- und 67NR-Zellen nicht einsortiert wurden 2D, was einmal mehr bestätigt, dass unterschiedliche Adhäsionen zwischen Zellen nicht der Haupttreiber für die Zellsortierung in unserem System sind, und die Notwendigkeit einer Zell-ECM-Schnittstelle hervorhebt, um die Zellsortierung zu initiieren35.

Nach der Sortierung der 4T1- und 67NR-Zellen in Sphäroiden am 3. und 4. Tag erfolgte die Invasion am 5. und 6. Tag (Abb. 2a, 5a und S4c). Ein Mechanismus, durch den Krebszellen kollektiv eindringen können, ist die kooperative Invasion: Invasive Führungszellen erzeugen Mikrospuren innerhalb der ECM, durch die nicht-invasive Zellen folgen können18,19,20,21. Da 4T1- und 67NR-Zellen unterschiedliche invasive Fähigkeiten aufweisen, gingen wir davon aus, dass 4T1-Zellen die kooperative Invasion der nicht-invasiven 67NR-Zellen ermöglichen könnten. Um diese Hypothese zu testen, analysierten wir die gemischten Sphäroide am Tag 6 nach der Einbettung. Wir beobachteten, dass die in den gemischten Sphäroiden vorhandenen nicht-invasiven 67NR-Zellen in die Kollagen-I-Matrix eindrangen (Abb. 5a). Dementsprechend stellten wir fest, dass gemischte Sphäroide im Vergleich zu reinen 67NR-Sphäroiden eine höhere Anzahl von Strängen pro Sphäroid aufwiesen (Abb. 5b) und etwa ein Drittel der Stränge 67NR-Zellen enthielten (Abb. 5c). Wichtig ist, dass bei gemischten Sphäroiden der Großteil der Stränge von 4T1-Zellen geleitet wurde (Abb. 5d), die Invadopodien zusammenbauen (Abb. 1h). In Übereinstimmung mit der MMP-Abhängigkeit der Invasion von 4T1-Zellen (Abb. 1a) blockierte GM6001 die Invasion gemischter Sphäroide (Abb. 4a – c). Während der kooperativen Invasion wurde die Zellsortierung zwischen 4T1- und 67NR-Zellen sowohl in den invasiven Strängen als auch innerhalb des Sphäroids aufrechterhalten (Abb. 5e – g), wobei die 4T1-Zellen die Grenzfläche zwischen Sphäroid und Matrix auskleideten. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die kooperative Invasion gemischter Sphäroide in Kollagen I MMP-abhängig ist, wobei 4T1-Zellen die Führungsposition einnehmen.

a Sphäroide aus einzelnen oder gemischten (1:50) 4T1-mScarlet- und 67NR-GFP-Zellen, abgebildet am Tag 6 nach der Einbettung. Sphäroide wurden mit DMSO-Kontrolle (linke Tafel) oder GM6001 (rechte Tafel) behandelt. Maßstabsbalken: 100 µm. Anzahl der Stränge pro Sphäroid (b), die Anzahl der Stränge, die 67NR-Zellen enthalten (67NR +) (c) und der Prozentsatz der Stränge, die von 4T1-mScarlet-Zellen (magentafarbene Kästchen) oder 67NR-GFP-Zellen (grüne Kästchen) angeführt werden (d) für einzelne oder gemischte (weißer Kasten) Sphäroide aus (a). Die roten leeren Symbole zeigen Nullwerte an. P = 1,90 × 10−7 (b) und 9,86 × 10−6 (c), nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. e Mittlerer Schnitt gemischter Sphäroide aus (a). Maßstabsbalken: 100 µm. f Koordinaten von 4T1-mScarlet- (Magenta) und 67NR-GFP-Zellen (grüne Kreuze) aus gemischten Sphäroiden in (e). In Strängen vorhandene Zellen wurden in die Analyse ausgeschlossen (linkes Feld) oder einbezogen (mittleres Feld). g DIs für 4T1-mScarlet- (Magenta) und 67NR-GFP-Zellen (grün) aus Sphäroiden in (e, f). P < 2,20 × 10−16 und <2,20 × 10−16, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. h Sphäroide von Ecad-CTL-, -KD1- oder -KD2-Zellen, gemischt mit 67NR im Verhältnis 1:50, abgebildet am Tag 6 nach der Einbettung. Maßstabsbalken: 100 μm. Anzahl der Stränge (i) und Anzahl der Stränge, die 67NR-GFP-Zellen enthalten (67NR + ) (j) für Sphäroide aus (h). P = 0,02 und 6,1 × 10−5 in (i); 0,00073 und 8,70 × 10−8 in (j), durch den Wilcoxon-Rangsummentest. k Anzahl der Einzelzellen, die außerhalb des Sphäroidkerns gefunden wurden, für Sphäroide aus (h). P = 0,02 und 6,1 × 10−5.

Unsere bisherigen Ergebnisse legen nahe, dass der 4T1-vermittelte ECM-Abbau erforderlich ist, damit 67NR-Zellen in die Kollagen-I-Matrix gelangen. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Anwesenheit von 4T1-Zellen in der Kollagen-I-Matrix notwendig und ausreichend ist, um das Kollagen abzubauen und Mikrospuren zu erzeugen. Um dies zu bestätigen, haben wir, anstatt 4T1-Zellen mit 67NR-Zellen in einem Sphäroid vorzumischen, 67NR-Sphäroide in eine mit 4T1-Zellen besiedelte Kollagen-I-Matrix eingebettet. Ähnlich wie bei unseren Beobachtungen bei gemischten Sphäroiden stellten wir fest, dass in Gegenwart von 4T1-Zellen in der Kollagen-I-Matrix 67NR-Zellen in die Matrix eindrangen und dass diese Invasion MMP-abhängig war (Abb. S7a, b). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass von 4T1-Zellen freigesetzte lösliche MMPs die Invasion von 67NR-Zellen in die Kollagen-I-Matrix erleichterten, kultivierten wir Sphäroide von 67NR-Zellen mit konditioniertem Medium aus 4T1-Zellen. Wir fanden heraus, dass die Bereitstellung von konditioniertem Medium von 4T1-Zellen für 67NR-Zellen nicht ausreichte, damit 67NR-Zellen in die Kollagen-I-Matrix eindringen konnten (Abb. S7c, d). In gemischten Sphäroiden identifizierten wir Mikrospuren innerhalb der Kollagen-I-Matrix, gefüllt mit führenden 4T1-Zellen und folgenden 67NR-Zellen (Abb. S7e). Frühere Berichte über eine heterotypische kooperative Invasion zwischen krebsassoziierten Fibroblasten und Epithelkrebszellen haben gezeigt, dass heterotypische N-Cadherin/E-Cadherin-Adhäsionen beteiligt sind37. Wir konnten keine heterotypischen E-Cadherin/N-Cadherin-Übergänge zwischen 4T1- und 67NR-Zellen nachweisen (Abb. S8a – c), was darauf hindeutet, dass die kooperative Invasion zwischen diesen Zellen nicht von E-/N-Cadherin-Wechselwirkungen abhängt. Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass 4T1-Zellen die Kollagen-I-Matrix abbauen und 67NR-Zellen in die von 4T1-Zellen erzeugten Mikrospuren wandern.

Wir haben uns gefragt, ob die Hemmung von E-Cadherin, die keinen Einfluss auf die Zellsortierung hatte (Abb. 3f, g), die kooperative Invasion beeinflussen kann. Um dies zu testen, haben wir 4T1-, Ecad-CTL-, -KD1- und -KD2-Sphäroide am 6. Tag abgebildet, wenn die Invasion stattfindet (Abb. 5h). Während die Ecad-KD1-Zelllinie einen teilweisen Übergang von der kollektiven zur Einzelzellinvasion mit invasiven Strängen und einzelnen invasiven Zellen zeigte, wurde bei Ecad-KD2 ein vollständiger Übergang zur Einzelzellinvasion beobachtet. In ähnlicher Weise zeigten beide Ecad-KD-Zelllinien in den gemischten Sphäroiden, die 67NR-Zellen mit entweder Ecad-CTL oder -KDs enthielten, eine Einzelzellinvasion, während Ecad-CTL- und Ecad-KD1-Zellen invasive Stränge bildeten (Abb. 5i – k). Um das Auftreten einer kooperativen Invasion sowohl im kollektiven als auch im Einzelzell-Invasionsmodus zu quantifizieren, haben wir die Anzahl der 67NR-Follower gemessen, die entweder in Strängen (Abb. 5j) oder als einzelne Zellen (Abb. 5k) vorhanden sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass 67NR zwar Ecad-KD1-Zellen folgen kann, die invasive Stränge beibehalten (Abb. 5i), bei einem vollständigen Übergang zur Einzelzellinvasion, wie beispielsweise bei gemischten Sphäroiden von Ecad-KD2 und 67NR, die kooperative Invasion verloren geht (Abb. 5k).

Angesichts der Tatsache, dass ein 4T1-vermittelter ECM-Abbau für eine kooperative Invasion erforderlich ist (Abb. 4 und S6) und dass 4T1-Leaderzellen Invadopodien zusammenbauen (Abb. 1h), fragten wir uns, ob der spezifische Zusammenbau von Invadopodien durch 4T1-Zellen für den ECM-Abbau verantwortlich war. Um rigoros zu bestätigen, dass die Invadopodienfunktion für die kooperative Invasion von Krebszellen erforderlich ist, haben wir Invadopodien in 4T1-mScarlet-Zellen durch einen Knockdown von Maus-Tks5 (Tks5-KD)13 stabil eliminiert und die entsprechende Kontrollzelllinie (Tks5-CTL) etabliert (Abb. 6a, oben, 78,1 % Knockdown-Wirkungsgrad). Wir haben auch bestätigt, dass die Tks5-CTL- und Tks5-KD-Zelllinien immer noch E-Cadherin exprimierten (Abb. 6a, unten), das an den Verbindungsstellen zwischen Tks5-CTL- und Tks5-KD-Zellen in Sphäroiden lokalisiert war (Abb. S9a, b). . Wir haben durch einen Gelatineabbautest in 2D und einen Sphäroidinvasionstest in 3D bestätigt, dass Tks5-KD-Zellen ihre Invasionsfähigkeit verloren haben (Abb. 6b – e). Anschließend führten wir den Sphäroidinvasionstest mit gemischten Sphäroiden durch, die Tks5-CTL- und Tks5-KD-Zellen enthielten. Am zweiten Tag nach der Einbettung stellten wir fest, dass sowohl Tks5-CTL-Zellen als auch die nicht-invasiven Tks5-KD-Zellen in die Kollagen-I-Matrix eingedrungen waren (Abb. 6d). Gemischte Sphäroide hatten eine ähnliche Anzahl an Strängen wie Tks5-CTL (Abb. 6e), und die meisten Stränge enthielten beide Zelltypen (Abb. 6f) und wurden von Tks5-CTL-Zellen angeführt (Abb. 6g). Um zu testen, ob die kooperative Invasion zelltypspezifisch war, wählten wir die metastatische menschliche Zelllinie MDA-MB-231, die kein E-Cadherin exprimiert und funktionelle Invadopodien aufbaut13. Durch den Abbau von menschlichem Tks5 in MDA-MB-231-Zellen (Abb. S10a – c) beobachteten wir, dass Zellen ohne Invadopodien in der Lage waren, Zellen mit Invadopodien durch kooperative Invasion zu folgen (Abb. S10d – g), was unsere Ergebnisse verstärkte. Um die Bedeutung von Invadopodien bei der kooperativen Invasion von Krebszellen weiter zu testen, haben wir gemischte Tks5-KD- und 67NR-GFP-Sphäroide erzeugt. Hier konnten wir keine invasiven Stränge beobachten (Abb. 6h, i). Schließlich validierten wir die Schlussfolgerung mit einer anderen Tks5-shRNA-Sequenz, Tks5-KD2, die ähnliche Ergebnisse wie Tks5-KD lieferte (Abb. S11). Insgesamt zeigen wir, dass in Leaderzellen während einer kooperativen Invasion funktionelle Invadopodien erforderlich sind, während in Folgezellen Invadopodien fehlen können.

eine Tks5- (oben) und E/N-Cadherin-Expression (unten) in Tks5-CTL- und Tks5-KD-Zellen. b Gelatineabbau durch Tks5-CTL (oberes Feld) und Tks5-KD (unteres Feld), 18 Stunden nach dem Plattieren. Die Einfügungen zeigen eine 2-fache Vergrößerung des umrahmten Bereichs und Pfeilspitzen zeigen eine repräsentative Verschlechterung an. Maßstabsbalken: 20 μm. c Abbaufläche pro Zelle für Tks5-CTL- und Tks5-KD-Zellen aus (b). P < 2,2 × 10−16, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. d Tag-2-Bilder von Sphäroiden aus Tks5-CTL-, -KD- oder einer Mischung aus Tks5-CTL- und -KD-Zellen (Verhältnis 1:1). Maßstabsbalken: 100 μm. Anzahl der Stränge pro Sphäroid (e), Anzahl der Stränge, die Tks5-KD-Zellen enthalten (f), und Prozentsatz der Stränge, die von Tks5-CTL- und -KD-Zellen angeführt werden (g), in Sphäroiden aus (d). P = 1,54 × 10−7 und 2,89 × 10−5, durch den Wilcoxon-Rangsummentest in (e). P = 6,69 × 10−11, nach dem t-Test in (f). h Tag 6-Bilder gemischter Sphäroide (Verhältnis 1:50) aus 67NR-GFP- und 4T1-mSCarlet- (4T1-mScar) oder Tks5-KD-Zellen. Maßstabsbalken: 100 μm. i Anzahl der Stränge pro Sphäroid aus (h). P = 3,36 × 10−6, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. j Gemischter 4T1-mScarlet- und 67NR-GFP-Tumor, markiert mit DAPI (blau). Maßstabsbalken: 50 μm. k Anzahl der Lungenkolonien pro cm2 für Mäuse, die mit 4T1-, 67NR-, Tks5-CTL- oder Tks5-KD-Zellen inokuliert wurden. Die roten leeren Symbole zeigen Nullwerte an. P = 0,032, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. l Anzahl der Lungenkolonien pro cm² für Mäuse, die mit einzelnen 67NR-Zellen oder gemischt mit 4T1-Zellen geimpft wurden; und einzelne Tks5-KD-Zellen oder gemischt mit Tks5-CTL-Zellen. Die roten leeren Symbole zeigen Nullwerte an. P = 0,032, nach dem Wilcoxon-Rangsummentest. Unbeschnittene Western Blots sind in den ergänzenden Abbildungen verfügbar. S16–S18.

Wir haben auch getestet, ob die Entfernung von Invadopodien die Zellsortierung beeinflusst. Wie erwartet fand keine Zellsortierung in gemischten Sphäroiden von Tks5-CTL- und Tks5-KD-Zellen statt (Abb. S12a), wohl aber in Sphäroiden, die Tks5-KD- und 67NR-GFP-Zellen enthielten (Abb. S12b). Diese Ergebnisse bestätigten, dass Invadopodien für die Zellsortierung nicht erforderlich sind. Da Tks5-CTL- und Tks5-KD-Zellen ähnliche Motilitäts- und Zell-ECM-Adhäsionseigenschaften aufweisen (Abb. S12c, d), verstärken diese Beobachtungen auch die Notwendigkeit einer unterschiedlichen Motilität und unterschiedlichen Zell-ECM-Empfindlichkeit für die Zellsortierung. Dementsprechend fand keine Zellsortierung in Sphäroiden statt, die 4T1-mScarlet- und 4T1-Wildtyp-Zellen enthielten (Abb. S12e, f).

Verbreitung und Metastasierung erfordern eine transendotheliale Migration von Krebszellen, d. h. Intravasation und Extravasation, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie von Invadopodien abhängig sind13,38. Während die interstitielle ECM im Primärtumor und den umgebenden Geweben durch die Bildung von Mikrospuren dauerhaft umgestaltet werden kann39, beinhaltet die transendotheliale Migration eine kurze, vorübergehende Öffnung der perivaskulären ECM40. Es ist nicht bekannt, ob invasive und nicht-invasive Zellen bei der Metastasierung ebenfalls kooperieren können. Um zu untersuchen, ob Zellen mit Invadopodien die Metastasierung von Zellen ohne Invadopodien ermöglichen können, haben wir Tumore mit einzelnen oder gemischten Zelllinien erzeugt. Nachdem die Tumoren einen Durchmesser von 6–9 mm erreicht hatten, führten wir den klonogenen Lungentest an verdauten Geweben durch. Um festzustellen, welcher Zelltyp metastatische Lungenkolonien bildete, nutzten wir die Unterschiede in der Expression fluoreszierender Proteine ​​oder der Arzneimittelempfindlichkeit. Wir haben bestätigt, dass der Tks5-Knockdown in den Tks5-KD-Tumoren aufrechterhalten wurde (Abb. S11i). Wir fanden heraus, dass die Tks5-KD-Zelllinien im 4T1- oder MDA-MB-231-Hintergrund und die 67NR-Zellen im Gegensatz zu Kontroll- und Wildtypzellen nicht zur Lungenmetastasierung fähig waren (Abb. 6k und S10i, S11j). Bei gleichzeitiger Injektion von 4T1- und 67NR-Zellen bildete 67NR keine Metastasen (Abb. 6l). Dies war nicht auf die Übernahme durch 4T1-Zellen zurückzuführen, da 67NR-Zellen im Tumorgewebe vorhanden waren (Abb. 6j). In ähnlicher Weise zeigte die gleichzeitige Injektion der MDA-MB-231-Kontrolle und des entsprechenden Tks5-Knockdowns, D2-KD, dass nur Kontrollzellen zur Metastasierung fähig waren (Abb. S10h, i). Interessanterweise wurden bei der gleichzeitigen Injektion von Tks5-KD mit Tks5-CTL-Zellen beide Zelltypen in der Lunge beobachtet (Abb. 6l), was darauf hindeutet, dass eine kooperative Metastasierung stattgefunden hat. Insgesamt implizieren diese Ergebnisse die Abhängigkeit der kooperativen Metastasierung von Invadopodien und von der E-Cadherin-Expression und/oder dem Vorhandensein von Zell-Zell-Verbindungen.

In dieser Studie zeigen wir, dass invasive Zellen während der kooperativen Invasion und Metastasierung von nicht-invasiven Zellen aussortieren und diese anführen können. Durch die Untersuchung der Zellbewegungen in Sphäroiden zeigen wir, dass unterschiedliche Persistenz und ECM-Empfindlichkeit die Zellsortierung zwischen Klonen steuern. Durch die Entfernung von Invadopodien und die Stummschaltung von Tks5 zeigen wir, dass Zellen mit Invadopodien Zellen ohne Invadopodien bei der kooperativen Invasion anführen und deren Metastasierung ermöglichen.

Wir bestätigen zuvor berichtete Beobachtungen, dass sich die invasiven 4T1-Zellen in einem hybriden epithelialen/mesenchymalen Zustand befinden, während die nicht-invasiven 67NR-Zellen mesenchymal sind27,28,29. Es wurde zuvor gezeigt, dass die Expression von Twist, die für Invadopodien8 notwendig ist, in 4T1-Zellen vorhanden ist, jedoch nicht in 67NR-Zellen41. Daher könnte die Twist-vermittelte EMT für die Unterschiede in den Invasionsfähigkeiten zwischen 4T1- und 67NR-Zellen verantwortlich sein41. Da 4T1-Zellen, aber nicht 67NR-Zellen funktionelle Invadopodien zusammenbauen, scheint es, dass für die Entstehung von Invadopodien eine spezifische EMT-Trajektorie, die Invadopodien gewährt, und nicht der Abschluss einer EMT erforderlich ist. Unsere Ergebnisse stehen im Einklang mit den jüngsten Erkenntnissen, dass Epithelzellen3,42 und hybride Epithel-/Mesenchymzellen metastasieren können, manchmal effizienter als Mesenchymzellen43,44.

Obwohl 67NR-Zellen die zentralen Invadopodia-Komponenten Cortactin und Tks5 exprimieren, gelingt es ihnen nicht, die Matrix abzubauen. Allerdings fehlt 67NR-Zellen aktives MMP-2 und MMP-9, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass MMP-14 (auch bekannt als MT1-MMP), die Protease, die üblicherweise für die Aktivierung von MMP-2 und MMP-9 verantwortlich ist, nicht oder nicht funktionsfähig ist an die Plasmamembran abgegeben werden45,46.

Hier decken wir die Rolle der unterschiedlichen Persistenz und der Zell-ECM-Empfindlichkeit bei der Etablierung der Zellsortierung bei Krebs auf. Klassische Studien zur Zellsortierung während der Entwicklung zeigten, dass die Zellsortierung häufig auf der unterschiedlichen Stärke der Zell-Zell-Adhäsionen35 oder auf Unterschieden in der Kontraktilität47 beruht. Im Gegensatz zu diesen Ansichten zeigen wir, dass 4T1- und 67NR-Zellen nicht auf einer 2D-Gelatineschicht oder bei Platzierung in einer 3D-Agarosematrix sortiert wurden. Die Bedeutung der unterschiedlichen Motilität bei der Sortierung wurde bereits bei der Gewebestrukturierung48 und bei manipulierten Brusttubuli vermutet, wo gezeigt wurde, dass sich mehr gerichtete Epithelzellen am Geweberand ansammeln49. Es wurde berichtet, dass während der Selbstorganisation der Milchgänge das Vorhandensein binärer Zell-ECM-Wechselwirkungen (ein- oder ausgeschaltet) die Zellsortierung reguliert36. Ähnlich wie unsere Beobachtungen haben Pawlizak et al. haben kürzlich gezeigt, dass die Sortierung von Brustzelllinien, die E-, N- oder P-Cadherin exprimieren, nicht durch die Hypothese der differentiellen Adhäsion erklärt werden kann50. Interessanterweise schlugen die Autoren vor, dass die Motilität für die Zellsortierung verantwortlich sein könnte.

Wir stellen fest, dass in den Sphäroiden, in denen hochbeständige, invasive Zellen, die gegenüber ECM empfindlich sind, mit nicht-invasiven, sich zufällig bewegenden Zellen vermischt sind, die Sortierung und Ansammlung invasiver Zellen an der Schnittstelle zwischen Sphäroid und ECM der kooperativen Invasion vorausgeht. Dies unterstreicht die Bedeutung der Untersuchung der Mechanismen, die die räumliche Organisation von Leader- und Follower-Zellen regulieren. Die Ansammlung von Leitzellen an der Sphäroid-Matrix-Grenzfläche kann die Geschwindigkeit und Effizienz der kooperativen Invasion erhöhen. Zur Unterstützung dieser Ansichten zeigte eine aktuelle Studie, dass die Zellsortierung der basalen Extrusion von Brustepithelzellen vorausgeht51. Wichtig ist, dass die Zellsortierung zwar katalytisch sein kann, für die kooperative Metastasierung in unserem System jedoch nicht unbedingt erforderlich zu sein scheint. Während gemischte 4T1-Tks5-KD- und Tks5-CTL-Zellen an der kooperativen Metastasierung beteiligt sind, aber nicht sortieren, sortieren Mischungen aus 4T1- und 67NR-Zellen, metastasieren jedoch nicht kooperativ.

Seit der Entdeckung der kooperativen Invasion wurden umfangreiche Arbeiten durchgeführt, um die Mechanismen aufzudecken, durch die heterogene Brustkrebszellpopulationen interagieren und sich gemeinsam mobilisieren. Unsere Arbeit legt nahe, dass die Invadopodia-Aktivität eine Determinante für den Phänotyp der Leitzelle ist. Wir haben zuvor gezeigt, dass die G1-Phase des Zellzyklus auch eine Determinante für die Identität der Leitzelle ist22. Im Einklang mit dieser vorliegenden Arbeit hatten wir auch nachgewiesen, dass Invadopodien in der G1-Phase des Zellzyklus angereichert sind22. Eine andere Studie ergab, dass Zellen, die Invasionsstränge anführen, im Vergleich zu Folgezellen eine höhere intrazelluläre Energie besitzen17. Insgesamt scheint es, dass der Zellzyklus, die intrazelluläre Energie und die Invadopodienfunktion bestimmende Faktoren für die Identität der Leitzelle sind. Allerdings muss das Zusammenspiel zwischen Zellzyklus, intrazellulärer Energie und Invadopodienfunktion im Zusammenhang mit der Entstehung von Anführern und Anhängern innerhalb einer Zellpopulation noch untersucht werden.

Zusammenfassend legt unsere Studie nahe, dass die Kooperativität zwischen Krebsklonen ein effizienter Mechanismus für die kollektive Metastasierung sein könnte. Insbesondere zeigen wir, dass Invadopodien eine kooperative Metastasierung ermöglichen und die Metastasierung nicht-invasiver Zellen ermöglichen. Unsere Ergebnisse zur kooperativen Metastasierung von 4T1 Tks5-KD mit Tks5-CTL stimmen mit dem vorherigen Nachweis der Verbreitung von Epithelzellclustern überein3. Im Gegensatz dazu metastasieren 67NR-Zellen nicht kooperativ, wenn sie mit 4T1 gemischt werden. Darüber hinaus metastasieren MDA-MB-231 Tks5-KD (D2-KD)-Zellen nicht kooperativ mit MDA-MB-231-Zellen. Beiden Zelllinien fehlt E-Cadherin, was darauf hindeutet, dass die kooperative Metastasierung von starken E-Cadherin-basierten Zell-Zell-Interaktionen abhängt. Interessanterweise stellt die kooperative Invasion im 3D-Sphäroid-Assay keine solche Anforderung dar, da sowohl 67NR- als auch D2-KD-Zellen ihren invasiven Gegenstücken erfolgreich folgen. Der wahrscheinliche Grund dafür ist, dass die durch die invasiven Leitzellen erzeugten Kollagendeformationen plastisch (permanent) sind und es entweder Zellsträngen oder einzelnen Zellen ermöglichen, durch sie zu wandern39. Im Gegensatz dazu sind Verformungen, die Leitzellen an der Blutgefäßwand erzeugen, elastisch (vorübergehend), und Folgezellen können Blutgefäßwände nur dann durchqueren, wenn sie starke Zell-Zell-Adhäsionen an der Leitzelle aufweisen.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass Krebszellen an einer kooperativen Metastasierung beteiligt sind, die schädlicher sein kann als die Metastasierung einzelner Zellen. Wir schlagen vor, dass die gezielte Bekämpfung von Invadopodien eine wirksame Strategie zur Hemmung der Metastasierung sowohl einzelner 13, 14 als auch kollektiv eindringender Zellen sein könnte.

Alle Experimente an Mäusen (Mus musculus) wurden gemäß den NIH-Vorschriften durchgeführt und durch das IACUC-Protokoll Nr. 4766 der Temple University genehmigt.

Sphäroid-Bildgebungsgeräte (SIDs) wurden wie zuvor beschrieben hergestellt33. Kurz gesagt wurden SIDs durch Binden von Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS)-Scheiben an die Glasbodenschalen (MatTek Corporation) hergestellt. Jede PDMS-Scheibe hat einen Durchmesser von 17,5 mm und enthält drei Vertiefungen mit einem Durchmesser von 5,5 mm, die für einzelne Sphäroide geeignet sind.

6-Well-Platten wurden wie zuvor beschrieben mit Gelatine beschichtet52. Kurz gesagt, jede Vertiefung wurde 10 Minuten lang mit einer 2,5 %igen Gelatinelösung beschichtet, gefolgt von einer 10-minütigen Behandlung mit 0,5 % Glutaraldehyd (Sigma-Aldrich) auf Eis und weiteren 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Platten wurden mit 70 % Ethanol und anschließend einer Behandlung mit 50 U/ml Penicillin – 50 µg/ml Streptomycin sterilisiert.

Die isogenen murinen Brustkrebszelllinien 4T1 und 67NR waren Geschenke von Dr. Fred R. Miller vom Karmanos Cancer Center und Dr. Jin Yang von der UCSD. Die menschliche Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 (HTB-26) wurde von der American Type Culture Collection bezogen. Die KD-Zelllinie MDA-MB-231-Dendra2-hTks5 wurde zuvor beschrieben und unter kontinuierlichem Druck von 0,5 µg/ml Puromycin und 500 µg/ml Geneticin gehalten13. Alle Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium [4,5 g/L D-Glucose, L-Glutamin] (DMEM, Gibco), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Atlanta Biologicals) und 50 U/ml Penicillin – 50 µg, kultiviert /ml Streptomycin (Gibco). Die Zellkulturen wurden maximal 60 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten.

Die 4T1-mScarlet- und 67NR-GFP-Zelllinien wurden durch Transfektion unter Verwendung eines 1:4-Verhältnisses von Plasmid-DNA:FugeneHD-Reagenz (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers erzeugt, gefolgt von einer Selektion mit 500 µg/ml Geneticin (Fisher BioReagents) und 3 µg/ml Puromycin (MP Biomedicals). pmScarlet-H-C1 war ein Geschenk von Dorus Gadella (Addgene-Plasmid # 85043). pEGFP-puro war ein Geschenk von Michael McVoy (Addgene-Plasmid Nr. 45561). Die MDA-MB-231-mScarlet-Zelllinie wurde durch Elektroporation (Lonza) des pmScarlet-C1-Plasmids gemäß den Anweisungen des Herstellers und Selektion mit 500 µg/ml Geneticin erzeugt. Nach zweiwöchiger Arzneimittelauswahl wurden die Zellen sortiert (BD FACSAriaIIµ, BD Biosciences) und die Subpopulationen gesammelt, die hohe Mengen an mScarlet oder GFP exprimierten.

Die Knockdown-Zelllinien Tks5-KD und -KD2, E-Cadherin-KD1 und -KD2 sowie die Knockdown-Kontrollzelllinien Tks5-CTL, Ecad-CTL und MDA-MB-231-mScarlet-CTL wurden durch Transduktion des 4T1 erzeugt -mScarlet-, 4T1- und MDA-MB-231-mScarlet-Zelllinien mit lentiviralen Partikeln (3 Viruspartikel/Zelle), die shRNA enthalten, die auf mTks5 abzielen (Klon-ID: TRCN0000105733, CGTGGTGGTGTCCAACTATAA; Klon-ID: TRCN0000105734, CCTCATACATTGACAAGCGCA), hTks5, zuvor beschrieben13 oder E-Cadherin (KD) (Klon-ID: TRCN0000042581, CCGAGAGAGTTACCCTACATA; Klon-ID: TRCN0000042579, CGGGACAATGTGTATTACTAT) oder nicht zielgerichtete shRNA (CTL) im pLKO.1-puro-Vektor (MISSION-Bibliothek, Sigma-Aldrich) und Auswahl mit 2 µg/ml Puromycin 3-7 Tage nach der Infektion. Zur Bestätigung der KD-Effizienz wurden Western Blots analysiert. Darüber hinaus Bilder von Ecad-CTL und Ecad-KDs, die mit E-Cadherin immunmarkiert und mit Cellpose segmentiert wurden. Dem Bild wurden Masken überlagert und die integrale Dichte pro Zelle wurde quantifiziert.

Kristallviolettfärbung wurde verwendet, um die Wirkung von Mitomycin C auf die Proliferation der 4T1-Zelllinie zu beurteilen. Kurz gesagt wurden 4T1-Zellen in eine Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät und am nächsten Tag wurde das Kulturmedium durch Kulturmedium mit 0,5 µg/ml Mitomycin C (resuspendiert in DMSO, Cayman Chemical) ersetzt. Nach 2 Tagen wurden die Zellen mit kaltem PBS gewaschen, 10 Minuten mit eiskaltem 100 % Methanol fixiert und 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,5 % Kristallviolettlösung in 25 % Methanol gefärbt. Überschüssiger Farbstoff wurde durch mehrere Wäschen mit Leitungswasser entfernt und die Platte über Nacht bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Der Farbstoff wurde mit 100 % Methanol 20 Minuten lang solubilisiert und die optische Dichte wurde auf einem Plattenlesegerät bei 570 nm abgelesen. Die optische Dichte bei 570 nm für Mitomycin C-behandelte Zellen wurde zur optischen Dichte bei 570 nm für DMSO-behandelte Zellen angegeben.

Gelatine wurde mit Alexa-405-NHS-Ester fluoreszierend markiert und 35-mm-Glasbodenschalen (MatTek Corporation) wurden wie zuvor beschrieben mit Alexa-405-Gelatine beschichtet31. Pro Schale wurden 400.000 (4T1/67NR) oder 300.000 (MDA-MB-231) Zellen ausplattiert und die Zellen 18 Stunden später mit 4 % Paraformaldehyd (Alfa Aesar) für 10 Minuten fixiert und mit 0,1 % Triton X-100 (Calbiochem) permeabilisiert. für 5 Minuten, blockiert mit 1 % FBS/1 % BSA (Sigma-Aldrich) in PBS (Gibco) für 3 Stunden, inkubiert mit Anti-Tks5-Antikörper (Millipore, MABT336) für 2 Stunden, dann mit sekundärem Antikörper und Alexa Fluor 633 Phalloidin (Invitrogen) für 1 Stunde.

Die Proben wurden auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (FV1200, Olympus) unter Verwendung eines 60X-Objektivs (UPLSAPO60XS, 1,35 NA, Olympus) abgebildet. Stapel wurden in einem Z-Schritt von 1 µm gesammelt. Um die Matrixverschlechterung zu quantifizieren, wurden Bilder mit einem benutzerdefinierten Makro in Fidschi verarbeitet. Kurz gesagt wurden Schnitte aus dem Stapel mit der Max-Intensity-Methode z-projiziert, gefolgt von einer Schwellenwertbestimmung des Signals im Gelatinekanal mit dem automatischen Schwellenwertalgorithmus und der Messung der Fläche der Abbaustellen mit dem Partikelanalyse-Tool. Um die Unterschiede in der Zelldichte in den verschiedenen Sichtfeldern zu berücksichtigen, wurde die gesamte Degradationsfläche in einem Sichtfeld durch die Gesamtzahl der in diesem Sichtfeld vorhandenen Zellen dividiert. Die Zellen wurden unter Verwendung der F-Actin-Färbung gezählt.

Platten mit 6 Vertiefungen wurden 20 Minuten lang mit 50 µg/ml Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich) beschichtet und an der Luft getrocknet. Die Zellen wurden ausplattiert und bis zur Konfluenz kultiviert, bevor mit einer 10-µl-Pipettenspitze eine kreuzförmige Wunde über die Monoschicht erzeugt wurde. Die Proben wurden auf einem Weitfeldmikroskop (IX-81, Olympus) abgebildet, das mit einer LED-Lampe (Excelitas Technologies), einer Orca 16-Bit-Kamera mit ladungsgekoppeltem Gerät (Hamamatsu) und einem automatischen Z-Drift-Kompensator IX3-ZDC (Olympus) ausgestattet war. , einem automatisierten Tisch (Prior Scientific), einer Umweltkammer (Live Cell Instrument) und unter Verwendung eines 10X-Objektivs (MPlanFL N 10X, 0,3 NA, Olympus). Die Zellmotilität wurde in 10-Minuten-Intervallen über 48 Stunden aufgezeichnet. Die manuelle Zellverfolgung wurde mit dem TrackMate-Plugin über Fiji53 durchgeführt. Die Spurnummer, die Spotkoordinaten und die Bildnummer wurden exportiert. Die Berechnung der Geschwindigkeit und Persistenz erfolgte mithilfe eines maßgeschneiderten Matlab-Codes.

Um Gelatineinseln zu erzeugen, verwendeten wir die PDMS-Einsätze (siehe Herstellung der Sphäroid-Bildgebungsgeräte (SIDs)). Kurz gesagt, 35-mm-Glasbodenschalen (MatTek Corporation) wurden 20 Minuten lang mit 50 µg/ml Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich) beschichtet und an der Luft getrocknet. Dann wurden PDMS-Ringe vorsichtig auf das Glas gelegt und durch leichtes Andrücken versiegelt. Als nächstes wurde jedes Loch mit 5,5 mm Durchmesser mit fluoreszierend markierter Gelatine beschichtet, wie zuvor beschrieben31 (siehe 2D-Gelatineabbautest). 4T1-mScarlet- und 67NR-GFP-Zellen wurden in jedem Loch im Verhältnis 1 zu 1 ausplattiert. Man ließ die Zellen eine Stunde lang anhaften, danach wurden die PDMS-Einsätze vorsichtig vom Glas abgezogen und Medium in die Schalen gegeben. Schließlich wurden die Zellen 24 Stunden später 10 Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd (Alfa Aesar) fixiert.

Die Proben wurden auf einem Weitfeldmikroskop (Eclipse Ti2-E, Nikon) abgebildet, das mit einer pco.panda sCMOS-Kamera (PCO) ausgestattet war und ein 10X-Objektiv (CFI Plan Fluor 10X, 0,3 NA, Nikon) verwendete. Zur Visualisierung der gesamten Oberfläche der Gelatineinsel wurden Kacheln (6 × 6) aufgenommen. Lebende Zellen wurden alle 10 Minuten und unter Verwendung einer Umweltkammer (Tokai Hit) abgebildet. Der Film wurde mit dem DrawArrowInMovie Fiji-Plugin54 kommentiert. Um den 2D-Zell-ECM-Klebstoff-Konkurrenztest zu quantifizieren, haben wir die Anzahl der 4T1- und 67NR-Zellen gezählt, die von den Gelatineinseln abwanderten. Um die Zellsortierung in 2D zu quantifizieren, verwendeten wir nur mit Gelatine beschichtete Regionen und zählten die Anzahl der homotypischen Nachbarn.

Die Messung des Kontaktwinkels wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt36. Kurz gesagt, 35-mm-Glasbodenschalen (MatTek Corporation) wurden mit fluoreszierend markierter Gelatine wie zuvor beschrieben31 oder mit 50 µg/ml Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich) für 20 Minuten beschichtet und an der Luft trocknen gelassen. Vor der Bildgebung wurden die Zellen 5 Stunden lang anhaften gelassen. Einzelne Zellen, die keine physikalische Wechselwirkung mit benachbarten Zellen hatten, wurden auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (FV1200, Olympus) unter Verwendung eines 60X-Objektivs (UPLSAPO60XS, 1,35 NA, Olympus) abgebildet, das mit einer Umweltkammer (In Vivo Scientific) ausgestattet war 1 µm Z-Schritt. Orthogonale Ansichten wurden verwendet, um den Winkel zwischen dem ECM und dem Hauptkörper der Zelle zu messen: den Kontaktwinkel.

Für 4T1- und 67NR-Zelllinien wurden 3D-Sphäroide mit der Methode des hängenden Tropfens erzeugt. 3000 Zellen pro 40-µl-Tropfen mit 4,8 mg/ml Methylcellulose (Sigma-Aldrich) und 20 µg/ml Nutragen (Advanced Biomatrix) wurden auf den Deckel von Gewebekulturschalen gegeben. Die Deckel wurden vorsichtig umgedreht und auf den Bodenbehälter der mit PBS gefüllten Schalen gelegt, um eine Verdunstung zu verhindern. Alternativ wurden für MDA-MB-231-Zelllinien 3D-Sphäroide in einer V-Bodenschale mit 96 Vertiefungen erzeugt, die mit 0,5 % Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (Sigma-Aldrich) in Ethanol beschichtet war. Anschließend wurden 5000 Zellen in 50 µl Medium auf jede Vertiefung verteilt und die Platte 20 Minuten lang bei 1000 × g und 4 °C zentrifugiert. Schließlich wurden jeder Vertiefung 50 µl Matrigel (Corning) in einer Endkonzentration von 2,5 % zugesetzt. Die Sphäroide wurden über 3 Tage bei 37 °C und 5 % CO2 gebildet, in 30 µl 5 mg/ml Rattenschwanz-Kollagen I (Corning, alternatives Gelierungsprotokoll) eingebettet und in die SIDs gegeben. Kollagen I wurde 30 Minuten lang bei 37 °C polymerisiert und dann wurde Kulturmedium zu den Schalen gegeben. Für medikamentöse Behandlungen wurde Zellkulturmedium mit 25 µM GM6001 (resuspendiert in DMSO, Cayman Chemical), 10 µM Y-27632 (resuspendiert in DMSO, Cayman Chemical) oder 0,1 % DMSO-Kontrolle verwendet.

Für die Experimente, bei denen 4T1-mScarlet-Zellen die 67NR-GFP-Sphäroide umgeben, wurden 4T1-mScarlet-Zellen vor der Polymerisation des Kollagens zu der Kollagenmischung mit den 67NR-GFP-Sphäroiden in einer Menge von 106 Zellen/ml hinzugefügt.

Für die Experimente, bei denen konditioniertes Medium verwendet wurde, wurden 4T1-mScarlet-Zellen mit 2 × 106 Zellen/Well auf eine mit Gelatine beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät. Pro Vertiefung wurden 2 ml komplettes DMEM verwendet und die eingebetteten 67NR-GFP-Sphäroide wurden ab Tag 0 unter Verwendung des konditionierten Mediums der auf Gelatine ausplattierten 4T1-mScarlet-Zellen kultiviert. Alle zwei Tage wurde das konditionierte Medium ausgetauscht.

Kollagen wurde wie zuvor beschrieben55 mit 2 µg/ml 405-Alexa-NHS-Ester (Biotium) markiert.

Um E-Cadherin zu blockieren, wurden 5 μg/ml des blockierenden Antikörpers (MABT26, Millipore) verwendet, um Zell-Zell-Adhäsionen zu zerstören. Ecad-KD-Sphäroide wurden wie zuvor beschrieben erzeugt19. Kurz gesagt, die Zellen wurden trypsinisiert und mit 1,5 × 104 Zellen/ml in vollständigem DMEM F12-Medium (5 % Pferdeserum, 0,5 µg/ml Hydrocortison, 20 ng/ml hEGF, 10 µg/ml Insulin, 100 ng/ml Choleratoxin) resuspendiert , 1 % Penicillin/Streptomycin) und 0,25 % Methylcellulose (Sigma-Aldrich). Die Zellsuspension wurde in nicht klebende 96-Well-Platten mit rundem Boden (Corning) ausgesät, 200 μl/Well. Die Platte wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1000 U/min zentrifugiert und 2 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 auf den Orbitalschüttler gestellt. Das Medium wurde durch ein vollständiges DMEM F12 ersetzt, das 0,25 % Methylcellulose (Sigma-Aldrich) und 1 % Matrigel (Corning) enthielt. Im Inkubator wurden 48 Stunden lang Sphäroide gebildet.

Die Immunfluoreszenzmarkierung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt33. Kurz gesagt, die eingebetteten Sphäroide wurden gleichzeitig in 4 % Paraformaldehyd und 0,5 % Triton bei 4 °C für 24 h auf einem Schüttler. Die eingebetteten Sphäroide wurden dann mit Anti-Kollagen I ¾ (immunoGlobe, 0207-050; 1 bis 100), Anti-E-Cadherin (Invitrogen, 13-1900; 1 bis 100), Anti-N-Cadherin (BD Transduction Laboratories, 610920; 1 bis 100) und Anti-Tks5 (Millipore, MABT336; 1 bis 100) über Nacht bei 4 °C und mit sekundären Antikörpern und Alexa Fluor 633 Phalloidin (Invitrogen; 1 bis 250) für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.

Sphäroide wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (FV1200, Olympus) mit einem 10-fachen (UPLXAPO10X, 0,4 NA, Olympus) oder einem 30-fachen Objektiv (UPLSAPO30XSIR, 1,05 NA, Olympus) unter Verwendung eines Z-Schritts von 3–5 µm abgebildet. Um die gesamte Sphäroidfläche zu quantifizieren, wurden Sphäroide mit DAPI markiert. Die Bilder wurden mit einem benutzerdefinierten Makro in Fidschi verarbeitet. Kurz gesagt, die Schnitte wurden mit der Max Intensity-Methode z-projektiert und die Kerne wurden mit dem Automatic Threshold-Algorithmus von Fidschi ausgewählt. Anschließend wurde das Partikelanalysetool verwendet, um die Gesamtfläche der Kerne zu messen.

Um das E-Cadherin-Signal zu quantifizieren, wurden die interessierenden Schnitte mit der Max-Intensity-Methode z-projektiert und Stränge oder einzelne Zellen identifiziert. Für das relative Verhältnis zwischen Verbindungsstelle und Zytosol wurde eine 10 µm lange Linie über die Verbindungsstelle zwischen zwei Zellen innerhalb eines Strangs gezogen und dort zentriert. Der Grauwert entlang der Linie wurde für den E-Cadherin- und F-Actin-Kanal mit dem Plot-Profile-Tool gemessen. Der Grauwert bei 0 und 5 µm wurde als „Cytosol“- bzw. „Junction“-Signal definiert.

Um die Zellsortierung zu quantifizieren, wurden Bilder mit einem benutzerdefinierten Makro in Fidschi verarbeitet. Da die maximale Projektion der Z-Scheiben Artefakte in den Positionen der Zellen in Bezug auf die Sphäroidkante gegenüber den Kernkompartimenten mit sich bringt, haben wir nur die mittlere Scheibe des Z-Stapels verwendet. Kurz gesagt, der Medianschnitt wurde aus dem Z-Stapel extrahiert und der Sphäroidkern im Hellfeldkanal mithilfe des Automatic Threshold-Algorithmus von Fiji ausgewählt. Anschließend wurden mithilfe der Optionen „Ellipse anpassen“ und „Schwerpunkt“ in „Messungen“ die Koordinaten des Mittelpunkts des Sphäroidkerns und der Hauptachse des Sphäroidkerns extrahiert. Schließlich wurde das Multi-Point-Tool verwendet, um die Koordinaten von GFP+- und mScarlet+-Zellen aufzuzeichnen. Die Zellsortierung wurde als Abstand vom Sphäroidzentrum zur Zelle (d in Abb. 2c) über der Haupthalbachse des Sphäroids (a in Abb. 2c) quantifiziert. Wir haben dieses Verhältnis als „Distance Index“ (DI) definiert. Alternativ wurde für gemischte Sphäroide, die nicht markierte Zellen enthielten, wie Tks5-CTL (Abb. 6) oder 4T1-Wildtyp-Zellen (Abb. S12), die DAPI-Färbung verwendet, um die Koordinate einer Zelle zu messen. Für eine bestimmte verfolgte Zelle haben wir ΔDI als DI für ihre Endposition minus DI für ihre Anfangsposition definiert.

Die Live-Bildgebung von Sphäroiden wurde entweder in Längsrichtung (täglich) durchgeführt, um die Zellsortierung zu analysieren, oder im Zeitraffer, um die Zellmotilität zu analysieren. Es wurde ein konfokales Mikroskop (FV1200, Olympus) mit einem 10X-Objektiv (UPLXAPO10X, 0,4 NA, Olympus) verwendet, das mit einer Umweltkammer (Live Cell-Instrument) ausgestattet war. Die Zellmotilität wurde in 10- oder 20-Minuten-Intervallen über 44 Stunden mit einem Z-Schritt von 15 µm aufgezeichnet. Für die Verfolgung wurden nur Schnitte verwendet, bei denen sowohl die Zellen aus dem Kern als auch die Randkompartimente sichtbar waren. Die Zellverfolgung wurde mit dem TrackMate-Plugin über Fiji53 durchgeführt. Die Spoterkennung erfolgte mithilfe des LoG-Detektors mit Medianfilterung und Subpixellokalisierung. Dann wurde der LAP-Tracker mit linearer Bewegung verwendet, um Spots zu verknüpfen. Die Tracks wurden basierend auf der Anzahl der Spots im Track mit einem Cutoff von ≥ 5 Spots/Track gefiltert. Die Tracks wurden mithilfe des TrackScheme-Tools visuell validiert und bei Bedarf korrigiert. Schließlich wurden Gleislücken durch die Einführung neuer Spots geschlossen. Die neue Spotposition wurde mittels linearer Interpolation berechnet. Für jede Spur wurde der Abstand vom ursprünglichen Fleck zur Sphäroid-Kollagen-I-Grenzfläche gemessen und wenn dieser Abstand ≤ 30 µm betrug, wurde die Spur als Kante klassifiziert, andernfalls wurde die Spur als Kern klassifiziert. Die Spurnummer, die Spotkoordinaten und die Bildnummer wurden exportiert. Die Berechnung des Distanzindex erfolgte mithilfe eines maßgeschneiderten Matlab-Codes (auf Anfrage erhältlich).

Die Koordinaten der einzelnen Zelltrajektorien wurden durch Partikelverfolgung mit dem Ursprung jedes Sphäroids bei (0,0) ermittelt und vom kartesischen Polarkoordinatensystem {x,y} in das Polarkoordinatensystem {r,ϕ} transformiert. Anschließend wurden mittlere quadratische Verschiebungen (MSDs) in radialer und Winkelrichtung berechnet, über verschiedene Sphäroide gemittelt und für verschiedene Bedingungen experimentell wiederholt. Die MSD-Daten wurden dann an ein Potenzgesetz angepasst, nämlich in beide Richtungen

Und

wobei \(({r}_{0},{\phi }_{0})\) dem Ursprung jeder Trajektorie im Polarkoordinatensystem entspricht, \({\Gamma }_{r,\phi }\ ) entsprechen den Amplituden der Potenzgesetze und \({\alpha }_{r,\phi }\) sind die Exponenten in radialer bzw. Winkelrichtung. MSD-Daten wurden mithilfe des Levenberg-Marquart-Algorithmus an diese Potenzgesetze angepasst, wobei der Anpassungsbereich im Intervall [0, 3 h] lag. Beachten Sie, dass die Motilität von Zellen für α < 1 subdiffusiv, für α = 1 diffusiv und für α > 1 superdiffusiv ist.

Da sich herausstellte, dass die Bewegung in radialer Richtung superdiffusiv ist, haben wir auch den durch 56 gegebenen zeitabhängigen effektiven Diffusionskoeffizienten berechnet

ergebend

Es ist wichtig zu beachten, dass für Bewegungen, die nicht diffusiv sind, zeitabhängige \({{{{{{\rm{D}}}}}}}_{{{{{{\rm{eff}}} }}}}\left(t\right)\) ist die einzige Möglichkeit, einen Diffusionskoeffizienten mit den richtigen Einheiten zu schätzen und verschiedene Datensätze auf konsistente Weise zu vergleichen, solange dieselben Zeitpunkte für den Vergleich ausgewählt werden.

Die Zellen wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Schalen ausplattiert und bis zu einer Konfluenz von 80 % kultiviert. Die Zellen wurden in eiskaltem RIPA-Lysepuffer (Teknova) geerntet, ergänzt mit Proteaseinhibitoren (Complete Cocktail, Roche) und Phosphataseinhibitoren (Halt Cocktail, Sigma-Aldrich). SDS-PAGE wurde mit 20 µg Protein pro Probe durchgeführt, auf eine Polyvinylidendifluoridmembran (Immobilon) übertragen, 3 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 5 % BSA/TBST blockiert und mit Anti-β-Actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-) inkubiert. 47778; 1 bis 500), Anti-Cortactin (Abcam, ab33333; 1 bis 1000), Anti-E-Cadherin (BD Transduction Laboratories, 610181; 1 bis 1000), Anti-FAK (Santa Cruz Biotechnology, sc-271126, 1 Anti-Phospho-FAK (Tyr397) (Invitrogen, 44625 G, 1 bis 100), Anti-N-Cadherin (BD Transduction Laboratories, 610920; 1 bis 500) und Anti-Tks5 (Millipore, MABT336; 1 bis 500). ) Antikörper verdünnt in 5 % BSA/TBST über Nacht bei 4 °C. Die Membranen wurden dann mit HRP-konjugierten Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern (Cell Signaling Technologies; 1 bis 5000), verdünnt in 5 % fettfreier Milch/TBST, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, und die Proteine ​​wurden mithilfe von Chemilumineszenz-Nachweisreagenzien sichtbar gemacht (WesternBright, Advansta) und Blot-Scanner (C-DiGit, LI-COR).

Um bei Mäusen Tumore zu bilden, wurden 200.000 Zellen in 100 μl 20 % Kollagen I in PBS suspendiert und orthotopisch in das Brustfettpolster von 7 Wochen alten weiblichen Mäusen injiziert. Bei der Inokulation mit Mischungen aus 4T1- oder MDA-MB-231-Zellen betrug das Zellverhältnis 1:1 und bei 4T1:67NR 1:300. Als der Tumordurchmesser 8–12 mm erreichte, 14–20 Tage bei Balb/cJ-Mäusen für 4T1 und 67NR, 8–10 Wochen bei SCID-Mäusen für MDA-MB-231, wurden die Tiere getötet und die Tumore und Lungen entnommen. Für den klonogenen Lungentest (https://doi.org/10.5281/zenodo.6639302) wurden die Lungen zerkleinert, in einem Kollagenase-Typ-IV/Elastase-Cocktail (Worthington Biochemical) verdaut und durch ein 70-μm-Netz filtriert. Anschließend wurde die Zellsuspension aus jeder Lunge auf zwei Gewebekulturplatten aufgeteilt. Eine Platte wurde mit einer Kombination aus 6-Thioguanin (Cayman Chemicals) und Puromycin zum Wachstum von Tks5-CTL- und Tks5-KD-Zellen inkubiert. Die andere Platte wurde mit einer Kombination aus 6-Thioguanin, Puromycin und Geneticin nur für das Wachstum von 4T1 Tks5-KD-Zellen oder mit einer Kombination aus 0,5 µg/ml Puromycin und 500 µg/ml Geneticin (Invitrogen) für das Wachstum von MDA-Zellen inkubiert. MB-231 D2-KD. Nach 14 Tagen bei 37 °C und 5 % CO2 wurden die Kolonien in Methanol fixiert, mit 0,03 % (w/v) Methylenblau (Sigma-Aldrich) gefärbt und gezählt (4T1 und 67NR) oder mittels Fluoreszenzmarkierung (D2) gezählt -KD).

Um Western-Blots an Tumoren durchzuführen, wurden Tks5-KD-Tumoren geerntet, zerkleinert und in einer frisch zubereiteten Kollagenase-Typ-III-Lösung (Worthington Biochemical) in HBSS verdaut, durch ein 70-μm-Netz filtriert und 7 Tage lang in dem mit 6- Thioguanin und Geneticin. Die Zellen wurden wie oben beschrieben lysiert.

Um Tumorschnitte abzubilden, wurden Tumore über Nacht in 4 % PFA bei 4 °C fixiert, 1 Stunde mit eiskaltem PBS gewaschen, in 30 % Saccharoselösung überführt und über Nacht bei 4 °C inkubiert, eingebettet, in OCT eingefroren und bei 6 °C geschnitten µm Dicke. Um das 67NR-GFP-Signal zu erhöhen, wurden gemischte 4T1-67NR-Tumoren mit Anti-GFP-Antikörper-Primärantikörper (ab13970, 1 bis 100) und Ziegen-Anti-Huhn-IgY H&L (Alexa Fluor® 488, ab150169) markiert und die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt .

Zur Durchführung aller statistischen Analysen wurde die Software RStudio verwendet. Die Verteilung jedes Datensatzes wurde analysiert und der Shapiro-Wilk-Test wurde durchgeführt, um die Normalität zu testen. Für normalverteilte Datensätze wurde ein F-Test durchgeführt, um die Varianzen zweier Datensätze zu vergleichen. Basierend auf den Ergebnissen des F-Tests wurde ein Welch-T-Test mit zwei Stichproben oder ein T-Test mit zwei Stichproben durchgeführt, um die Mittelwerte der beiden Datensätze zu vergleichen. Für nicht normalverteilte Datensätze wurde ein Wilcoxon-Rangsummentest durchgeführt, um die beiden Datensätze zu vergleichen. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Tests nach ungepaarten und zweiseitigen Kriterien durchgeführt. Alle Daten werden als Liniendiagramme oder Boxplots mit Median (Linie), 25./75. Perzentil (Boxen) und Maximum/Minimum (Whisker) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde als *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 definiert. Weitere Informationen zu den Metriken und Statistiken finden Sie in der Quelldatendatei. Alle Daten sind auf Anfrage erhältlich.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen Zusatzinformationen als Zusatzdaten 1 enthalten. Legenden zu Quelldaten und Filmen finden Sie in der Beschreibung zusätzlicher Zusatzmaterialien. Das Plasmid pmScarlet-H-C1 war ein Geschenk von Dorus Gadella (Addgen-Plasmid Nr. 85043), während pEGFP-puro ein Geschenk von Michael McVoy (Addgen-Plasmid Nr. 45561) war. Unbeschnittene Western Blots sind in den ergänzenden Abbildungen verfügbar. S13–S27.

Der gesamte Code für die Datenverarbeitung und -analyse im Zusammenhang mit der aktuellen Einreichung ist unter https://github.com/tuzellab/cooperative_invasion und (https://doi.org/10.5281/zenodo.6639302) verfügbar.

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Wir möchten dem Durchflusszytometrie-Kern der Lewis Katz School of Medicine für die Unterstützung bei der Zellsortierung sowie den Mitgliedern von Temple Bioengineering und Fox Chase Cancer Center Biology für wertvolle Diskussionen danken. Die Finanzierung erfolgte durch NIH R00 CA172360, R01 CA230777 (BG) und R01 GM121679 (ET); American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM (BG) und Conquer Cancer Now/Young Investigator Award (BG).

Louisiana Perrin

Derzeitige Adresse: Institut Curie, UMR144, Paris, Frankreich

Abteilung für Bioingenieurwesen, Temple University, Philadelphia, PA, USA

Louisiane Perrin, Elizaveta Belova, Battuya Bayarmagnai, Erkan Tüzel und Bojana Gligorijevic

Programm für Krebssignalisierung und Epigenetik, Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA, USA

Bojana Gligorijevic

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Konzeptualisierung: LP, BG, Datenerfassung: LP, EB, BB, BG, Analyse: LP, EB, BG, ET, Supervision: BG, Schreiben: LP, EB, BB, ET, BG

Korrespondenz mit Bojana Gligorijevic.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Jing Yang, Feng Chiao Tsai und Díaz Begoña für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Ruby Huang und Eve Rogers. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Perrin, L., Belova, E., Bayarmagnai, B. et al. Invadopodien ermöglichen eine kooperative Invasion und Metastasierung von Brustkrebszellen. Commun Biol 5, 758 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03642-z

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Eingegangen: 16. Juni 2021

Angenommen: 28. Juni 2022

Veröffentlicht: 01. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03642-z

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