Kryo

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1775 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der apikale Komplex ist eine spezialisierte Ansammlung von Zytoskelett- und Sekretionsmechanismen bei apikomplexen Parasiten, zu denen auch die Krankheitserreger gehören, die Malaria und Toxoplasmose verursachen. Seine Struktur und sein Bewegungsmechanismus sind kaum verstanden. Wir verwendeten Kryo-FIB-Fräsen und Kryo-Elektronentomographie, um die 3D-Struktur des apikalen Komplexes in seinem hervorstehenden und zurückgezogenen Zustand zu visualisieren. Durchschnittliche Konoidfasern zeigten ihre Polarität und ungewöhnliche Neun-Protofilament-Anordnung mit zugehörigen Proteinen, die die Fasern verbinden und wahrscheinlich stabilisieren. Weder die Struktur der Konoidfasern noch die Architektur des spiralförmigen Konoidkomplexes ändern sich während der Protrusion oder Retraktion. Somit bewegt sich der Konoid als starrer Körper und ist nicht federartig und komprimierbar, wie zuvor angenommen. Stattdessen dehnen sich die Apikal-Polar-Ringe (APR), die früher als starr galten, während der Konoidprotrusion aus. Wir haben aktinähnliche Filamente identifiziert, die das Konoid und den APR während der Protrusion verbinden, was auf eine Rolle bei Bewegungen des Konoids schließen lässt. Darüber hinaus erfassen unsere Daten die Parasiten beim Sekretionsvorgang während der Konoidprotrusion.

Alle intrazellulären Krankheitserreger müssen in eine neue Wirtszelle eindringen. Apicomplexan-Parasiten nutzen eine Invasionsmaschinerie, die aus einem speziellen Zytoskelettkomplex und sekretorischen Organellen besteht. Zusammenfassend wird diese Gruppe von Organellen als apikaler Komplex bezeichnet. Nach dieser Struktur ist der Stamm Apicomplexa benannt, zu dem die Erreger von Malaria, Toxoplasmose und Kryptosporidiose gehören. Apicomplexan-Parasiten gehören wie Ciliaten und Dinoflagellaten zum eukaryotischen Superstamm Alveolata (ergänzende Abbildung 1). Der apikale Komplex ist für die Motilität des Parasiten sowie für das Eindringen in und den Austritt aus Wirtszellen von wesentlicher Bedeutung. Darüber hinaus blockieren Mutationen, die die Funktionen des apikalen Komplexes stören, den Apicomplexan-Lysezyklus, wodurch sie nicht infektiös werden1,2,3,4.

Das apikale komplexe Zytoskelett selbst ist eine ca. 250 nm lange Struktur (ca. 25 % der Länge eines E. coli), die aus einer Reihe von Ringen besteht, die um eine zentrale Spirale aus speziellen Tubulinfasern, dem sogenannten Konoid, angeordnet sind und in deren Inneren sekretorische Organellen organisiert sind und zur Sekretion vorbereitet (Abb. 1a). Während die Konoidfasern aus denselben Tubulin-Dimeren bestehen, aus denen die subpellikulären Mikrotubuli der Parasiten bestehen, bilden sie keine geschlossenen Röhren5. Stattdessen bilden die konischen Fasern eine offene „C“-förmige Struktur5. Der Konoidkomplex ist hochdynamisch: Er ragt vor und zurück6, während die Parasiten Adhäsine und andere Motilitäts-/Invasionsfaktoren7,8 absondern. Bemerkenswerterweise scheint sich der apikale Komplex aus einem eukaryontischen Cilium entwickelt zu haben, da er sowohl Tubulin als auch Cilium-assoziierte Proteine ​​enthält9,10,11,12. Darüber hinaus ist der Kern des apikalen Komplexes, einschließlich des Konoids und seiner spezialisierten Tubulinstrukturen, nicht nur in Apicomplexa13,14 und in eng verwandten frei lebenden Organismen15, sondern auch in weiter entfernt verwandten Alveolaten wie Dinoflagellaten16,17 (Supplementary Abb. 1). Somit scheint es sich bei dem apikalen Komplex um eine uralte Struktur zu handeln, deren molekulare Zusammensetzung, hochauflösende Struktur und mechanistisches Verständnis seiner Funktionen immer noch weitgehend ein Rätsel sind.

Eine Cartoon-Übersicht über die Komponenten des apikalen Kokzidienkomplexes im Vergleich des hervorstehenden und zurückgezogenen Zustands. Dieses Farbschema wird im gesamten Manuskript verwendet. b Tomographischer Schnitt durch einen teilweise zurückgezogenen Konoid, der in Querschnittsausrichtung mit Kryo-FIB gefräst wurde, zeigt deutlich die SPMTs, die in der Nähe des AAD-Rings enden, und mit AAD-Projektionen (violette Pfeile), die zwischen benachbarten SPMTs verstreut sind. c Tomographischer Schnitt des rekonstruierten apikalen Endes von N. caninum mit hervorstehendem Konoid. Beachten Sie die Dichte, die die beiden Membranen des inneren Membrankomplexes verbindet (IMC, cyanfarbene Pfeilspitzen). Weitere Beschriftungen und Farben finden Sie unten. d 3D-Segmentierung und Visualisierung des apikalen Komplexes aus einem hervorstehenden Konoid (anderes Tomogramm als (c)). Sofern nicht anders angegeben, werden im gesamten Manuskript Beschriftungen und Farben verwendet: AAD (lila), amorpher APR-assoziierter Dichtering und Projektionen; Aktin-ähnliche Filamente (Magenta in (c)); APR (rot), apikale Polringe; CF (orange) Konoidfaser, ICMT (hellgrün) intrakonoidale Mikrotubuli, IMC (Cyan) innerer Membrankomplex, PCR (gelb) präkonoidale Ringe, PM (grau) Plasmamembran, SPMT (dunkelgrün) subpellikuläre Mikrotubuli. e Tomographischer Schnitt des rekonstruierten apikalen Endes eines gefrästen N. caninum mit zurückgezogenem Konoid, beschriftet wie in (c). f 3D-Segmentierung und Visualisierung eines zurückgezogenen Konoids (anderes Tomogramm als (e)) und gefärbt wie in (d). In Längsansichten ist eine apikale Spitze im gesamten Manuskript zum oberen Rand der Bilder ausgerichtet, sofern nicht anders angegeben. Maßstabsbalken: 100 nm (in b–e).

Zu den gemeinsamen ultrastrukturellen Merkmalen des Alveolata-Superstamms gehören die vom Zytoskelett getragenen vesikulären Strukturen, die direkt basal zur Plasmamembran liegen und als Alveolen bekannt sind18. Bei Apicomplexans werden diese Strukturen als innerer Membrankomplex (IMC) bezeichnet, der sich entlang der Länge des Parasiten erstreckt19,20,21,22. Apicomplexan-Parasiten verfügen über zwei unterschiedliche Sätze spezialisierter Organellen, die sogenannten Mikroneme und Rhoptrien, aus denen Invasionsfaktoren und Effektorproteine ​​abgesondert werden (Abb. 1a)23,24,25. Während die Rhoptry-Sekretion einen engen Kontakt mit der Plasmamembran der Wirtszelle erfordert, wird angenommen, dass Mikroneme kontinuierlich sezernieren, während die Parasiten extrazellulär sind. Obwohl diese sekretorischen Organellen bei Alveolaten nicht weitgehend konserviert sind, haben neuere Arbeiten gezeigt, dass die Sekretion aus den Rhoptrien durch einen Komplex vermittelt wird, der sowohl in seiner Struktur als auch in seinen Proteinkomponenten in Ciliaten wie Tetrahymena und Paramecium konserviert ist26,27.

Die zelluläre Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) ist eine leistungsstarke Bildgebungstechnik, die strukturelle Details mit molekularer Auflösung sichtbar machen kann, die geeignete Dicke biologischer Proben ist jedoch auf einige hundert Nanometer begrenzt28. Die meisten intakten eukaryotischen Zellen sind dicker. Daher haben frühere Kryo-ET-Studien ganzer eukaryotischer Zellen entweder von Natur aus dünne Zellregionen wie Lamellipodien29 und Zilien30 oder Zellen abgebildet, die aufgrund der Einbettung in eine dünne Eisschicht komprimiert wurden (Kompressionskraft durch Wasseroberflächenspannung)31,32 . Dickere Proben können dünn genug für die Kryo-ET gemacht werden, entweder durch gefrorene, hydratisierte Schnitte mit einem Messer – das zu Schnittartefakten neigt33 – oder durch kryofokussiertes Ionenstrahlfräsen34.

Wir haben Kryo-ET auf den Kokzidien-Apicomplexan-Parasiten Toxoplasma gondii, den wohl am weitesten verbreiteten und erfolgreichsten Parasiten der Welt, und seinen nahen Verwandten Neospora caninum angewendet. Unsere Studie verwendete hauptsächlich kryofokussiertes Ionenstrahlfräsen (Kryo-FIB) von ungestörten Zellen, die in dickes Eis eingebettet waren, um den apikalen Kokzidienkomplex in seinen hervorstehenden und zurückgezogenen Zuständen in situ zu vergleichen, ohne die Kompressions- und Verformungsartefakte, die Studien an ungemahlenen intakten Zellen geplagt haben Apicomplexan-Proben31,32,35. Unsere tomographischen Rekonstruktionen bieten einen unübertroffenen Einblick in die apikale komplexe Struktur. Durch die Subtomogramm-Mittelung der Konoidfasern konnten wir deutlich zeigen, dass der Konoid im Gegensatz zu einer weit verbreiteten Hypothese5,35 nicht federartig ist und sich während der Zyklen des Vorstehens und Zurückziehens nicht verformt. Wir beobachteten auch Filamente, die sich zwischen dem Konoid und den apikalen Polarringen (APR) erstrecken, durch die sich der Konoid bewegt, was darauf hindeutet, dass die Polymerisation von Aktin oder einem aktinähnlichen Protein bei der Bewegung des Konoids eine Rolle spielen könnte. Unsere Daten bieten auch einen beispiellosen Einblick in die Wechselwirkungen zwischen den sekretorischen Organellen des Parasiten und dem Zytoskelett des apikalen Komplexes. Schließlich konnten wir den Vorgang der Mikronemfusion mit der intakten Plasmamembran erfassen. Zusammen liefert diese Arbeit strukturelle und mechanistische Details für die Apikomplexan-Invasionsmaschinerie, den apikalen Komplex. Da dieser Komplex für die Infektion mit Apicomplexan-Parasiten essentiell ist, könnte das Verständnis der molekularen Grundlagen seiner Funktion wichtige neue Angriffspunkte für therapeutische Interventionen bei einigen der verheerendsten Krankheiten der Welt aufzeigen.

Das Kokzidien-Zytoskelett scheint nach Detergenzienextraktion und Negativfärbung bemerkenswert gut erhalten zu sein, was zu vielen TEM-Studien der Apicomplexan-Ultrastruktur mit dieser Präparationsmethode geführt hat1,4,5,36. Wir haben zunächst getestet, ob uns die Kryo-ET von mit Detergenzien extrahierten und dann tauchgefrorenen Toxoplasma-Zellen eine genaue 3D-Ansicht mit verbesserter Auflösung der Zytoskelettstrukturen im Vergleich zur herkömmlichen TEM von negativ gefärbten (getrockneten) Proben ermöglichen würde. Obwohl Kryo-ET von mit Detergens behandelten Proben Zytoskelettanordnungen wie das apikale Konoid und die subpellikulären Mikrotubuli bei hohem Kontrast erkennen lassen (ergänzende Abbildung 2), zeigen die Tomogramme auch Artefakte aus der Detergenzienextraktion sowie strukturelle Verzerrungen (z. B. Abflachung; vergleiche). Ergänzende Abbildung 2e – h), die es erschwerte, aus diesen Proben zuverlässige Strukturinformationen zu gewinnen.

Um die am wenigsten gestörten Proben und die höchste Qualität zu erhalten, haben wir daher intakte und lebende Parasiten in einer relativ dicken Eisschicht (> 1 μm dick; um eine Abflachung der Zellen durch die Oberflächenspannung des Wassers zu vermeiden) tiefgefroren. Anschließend verwendeten wir Kryo-FIB-Fräsen, um 150–200 nm dicke Lamellen der verglasten, aber ansonsten nativen Parasiten zu erzeugen (ergänzende Abbildung 3). Um diese Proben zu erzeugen, verwendeten wir den NC1-Stamm von Neospora caninum, einem BSL1-Organismus, der eng mit dem menschlichen Krankheitserreger Toxoplasma gondii verwandt ist (ergänzende Abbildung 1). Das Konoid extrazellulärer Parasiten ragt kontinuierlich heraus und zieht sich zurück – mit und ohne vorhandene Wirtszellen, aber kurz vor dem Tauchgefrieren wurden die Parasiten entweder in einem intrazellulär ähnlichen Puffer37 präpariert oder mit 10 μM Calciumionophor 10 Minuten lang inkubiert. so dass die Mehrzahl der Parasiten Konoide haben, vorzugsweise im zurückgezogenen bzw. hervorstehenden Zustand6, ohne die Beweglichkeit der Konoide oder zelluläre Funktionen wie die Sekretion zu blockieren. Die resultierenden Kryotomogramme zeigen gut erhaltene Strukturdetails des nativen apikalen N. caninum-Komplexes, einschließlich Membranen, Zytoskelettanordnungen und Organellen (Abb. 1 und Zusatzfilm 1).

Wir verglichen die Architektur des apikalen N. caninum-Komplexes in zwei Zuständen: Konoid hervorstehend und zurückgezogen. Im hervorstehenden Zustand (Abb. 1c, d und Zusatzfilm 1) sind die präkonoidalen Ringe (PCRs) die Zytoskelettstruktur, die der apikalen Plasmamembran am nächsten liegt (Abb. 1c, d), gefolgt vom zugehörigen Konoid, aus dem sie besteht 14–15 konische Fasern, spiralförmig angeordnet (Ergänzende Abbildung 2g, h). Im Vergleich zum hervorstehenden Konoidzustand sind die Konoidfasern im zurückgezogenen Zustand direkt basal zu den APRs verstaut, und die PCRs befinden sich leicht apikal der APR-Strukturen (Abb. 1e, f). Basal des hervorstehenden Konoids ist der innere Membrankomplex (IMC) deutlich als flache Doppelmembranstruktur mit zugehörigen Dichten direkt unterhalb der Plasmamembran des Parasiten zu erkennen (Abb. 1c, e). Bemerkenswert ist, dass unsere In-situ-Kryo-ET mehrere (nichtperiodische) Dichten aufdeckt, die eine Brücke zwischen den beiden Membranen des ausgedehnten blattartigen IMC bilden (cyanfarbene Pfeilspitzen in Abb. 1c, 2c) und möglicherweise als „Abstandshalter“ dienen, die den Abstand begrenzen zwischen den Membranen. Der apikale Rand der IMC-Platte ist an den apikalen Polringen (APRs; Abb. 1c – f) befestigt. Direkt unterhalb des IMC erstrecken sich etwa 22 subpellikuläre Mikrotubuli basal von den APRs (Abb. 1b – e). Obwohl die subpellikulären Mikrotubuli und die damit verbundenen inneren Mikrotubuli-Proteine ​​(MIPs) in unseren Kryotomogrammen gut aufgelöst sind, haben wir uns hier nicht auf sie konzentriert, da sie zuvor ausführlich analysiert wurden35,38.

Hochauflösende Lichtmikroskopie hat gezeigt, dass sich Komponenten des APR in unabhängige Ringe aufspalten39, aber diese Ringe waren mit negativer EM-Färbung schwer aufzulösen. In unseren Tomogrammen können wir deutlich mehrere ringförmige Strukturen in der Nähe des apikalen Randes des IMC erkennen: zwei unterschiedliche APRs mit ähnlichen Durchmessern, nämlich den A1-Ring (apikal) und den dickeren A2-Ring (basal), der möglicherweise aus zwei nahe beieinander liegenden besteht gestapelte Teilringe A2a und A2b (Abb. 2a, b und ergänzende Abb. 2d, 4a – c). Wir beobachten auch einen Ring amorpher Dichte (hier „amorphe APR-assoziierte Dichte“ oder AAD genannt), der sich zwischen dem IMC und den Spitzen der subpellikulären Mikrotubuli befindet (violette Pfeile/Struktur in Abb. 1b – f und ergänzende Abb. 2a). , d, 4a–c). Der AAD scheint mit den APR-Ringen verbunden zu sein und weist basale Vorsprünge (21 nm breit und 64 nm lang) auf, die zwischen benachbarten subpellikulären Mikrotubuli eingeschlossen sind (Abb. 1b). Die AAD-Projektionen wurden nicht aus konventionellen EM-Studien berichtet, wurden aber kürzlich in einer anderen Kryo-ET-Studie beobachtet (in Lit. 35 „interspersed pillars“ genannt). Wir beobachten die APRs, den AAD-Ring und die AAD-Projektionen in Tomogrammen sowohl des hervorstehenden als auch des zurückgezogenen Konoidzustands. Interessanterweise scheinen der AAD-Ring und die Vorsprünge während der Detergenzienextraktion des Parasiten erhalten zu bleiben (Ergänzende Abbildungen 2a, d, 4a, b). Diese Lokalisierung und das biochemische Verhalten legen nahe, dass der AAD-Ring und die Vorsprünge Komponenten der IMC-Apikalkappe enthalten könnten, die kürzlich durch hochauflösende Lichtmikroskopie als zwischen Mikrotubuli verschachtelt lokalisiert wurden4,40. Allerdings erstrecken sich in diesen Studien bekannte apikale Kappenproteine ​​wie ISP1 und AC9 etwa 1 μm vom APR entfernt, weit über die etwa 64 nm hinaus, die von den AAD-Projektionen eingenommen werden. Daher scheinen der AAD-Ring und die Vorsprünge aus Proteinen zu bestehen, die noch identifiziert oder genau lokalisiert werden müssen.

eine Zeichnung des apikalen Komplexes im hervorstehenden Zustand mit Hervorhebung der APR- und IMC-Strukturen. b Ein tomographischer Schnitt (Längsausrichtung) zeigt zwei deutliche APR-Ringe (rote Pfeilspitzen) und den AAD-Ring (violette Pfeilspitze), der sich zwischen APR und IMC befindet. c Eine tomographische Querschnittsschicht zeigt die IMC nahe der apikalen Kante mit „Abstands“-Dichten (cyanfarbene Pfeilspitzen) zwischen den beiden Membranen. d, e Tomographische Schnitte durch den hervorstehenden Konoidkomplex zweier Parasiten. Messungen markieren die Mindestabstände zwischen dem IMC und den Konoidfasern auf jeder Seite des Konoids. f, g Tomographischer Schnitt (f: Original; f': Pseudofarbe) und 3D-segmentierte Isoflächendarstellung (g) derselben Region an der Basis eines hervorstehenden Konoids zeigen filamentöse aktinähnliche Dichten (Magenta), die die Konoide verbinden (orange) und die effektiven Jahreszinsen (rot). Maßstabsbalken: 100 nm (in b, d, e); 50 nm (in c, f).

Überraschenderweise und im Gegensatz zu der Vorstellung, dass der APR dazu dient, den Konoid fest an der Parasitenmembran zu verankern, erscheint der hervorstehende Konoid in unseren Tomogrammen nie vollständig rechtwinklig zu den APRs (vergleiche hervorstehend in Abb. 1c, d, 2d, e mit zurückgezogen). in Abb. 1e, f und ergänzende Abb. 4d – f). Stattdessen scheint der Konoid in der Lage zu sein, sich zu neigen und relativ zum ringförmigen APR außermittig zu sein, wenn er hervorsteht. Um diese Beobachtung zu quantifizieren, verglichen wir die Abstände zwischen dem apikalen Rand des IMC und dem Basalrand des Konoids von gegenüberliegenden Seiten in zentralen Schnitten durch unsere Tomogramme (Abb. 2d, e und ergänzende Abb. 4d – f). Wir fanden heraus, dass der Unterschied zwischen den entgegengesetzten Abständen in Tomogrammen des hervorstehenden Zustands (Δd = 52 ± 12 nm; n = 3) stärker variierte als im zurückgezogenen Zustand (Δd = 10 ± 4 nm; n = 3). Diese Daten stimmten mit der Vorstellung überein, dass der Konoid durch flexible und möglicherweise dynamische Strukturen an die APRs und/oder den apikalen Rand des IMC mit dem AAD „angebunden“ ist. Tatsächlich beobachteten wir häufig Filamente zwischen der APR-Region und den Konoidfasern (Abb. 1d, 2f, g und ergänzende Abb. 4g – l).

Frühere Studien zeigten, dass die „Gleitmotilität“ von Apicomplexan durch das Treten von Aktinfasern zwischen dem IMC-Zytoskelett und der Plasmamembran des Parasiten angetrieben wird41,42. Kürzlich wurde mithilfe von F-Aktin-Nanokörpern gezeigt, dass Aktinfasern am Konoid entstehen und bei der Bewegung des Parasiten an den Parasiten weitergegeben werden3. Wir beobachten deutlich Filamente, deren Durchmesser mit Aktinfasern übereinstimmt (~8 nm Durchmesser), die sich vom Konoid bis zur Verbindung mit der APR-Region erstrecken, in der Nähe der Stelle, an der die Übergabe an das IMC-assoziierte Myosinnetzwerk41,43 zu erwarten wäre. Die Länge dieser Filamente variiert in unseren Tomogrammen zwischen 38 und 164 nm (n = 14 Fasern aus drei Tomogrammen), was darauf hindeutet, dass sie dynamischer Natur sind (Abb. 1d, 2f – g und ergänzende Abb. 4g – l).

Im Gegensatz zu intakten Parasiten scheint in unseren mit Detergenzien extrahierten Proben die Konoidbasis direkt auf den APRs zu sitzen (ergänzende Abbildungen 2a, 4a, b), wie dies typischerweise bei ähnlich behandelten Proben durch negative EM4,5,36-Färbung zu sehen ist . Dieser Zusammenbruch der Lücke und der filamentösen Strukturen lässt fälschlicherweise darauf schließen, dass der APR und seine Verbindungen zum Konoid viel starrer sind, als wir in unseren kryo-FIB-gemahlenen, aber ansonsten ungestörten Proben beobachten, was erneut den Wert unserer In-situ-Analyse unterstreicht der Strukturen in ihren Heimatstaaten.

Wie unten beschrieben, handelt es sich bei den Konoidfasern um ungewöhnliche Tubulinpolymere, bei denen die Protofilamente einen offenen C-förmigen Querschnitt bilden (Zusatzfilm 1). Diese Fasern wurden ursprünglich als eine Wunde in einer „federähnlichen“ Struktur beschrieben5, was zu einem Modell führte, dass die Konoidbewegungen durch einen federähnlichen Mechanismus angetrieben wurden, der Zyklen der Verformung in der Konoidstruktur mit anschließender Freigabe beinhaltete. Diese Hypothese wird durch die ungewöhnliche C-Form der konoiden Fasern attraktiver, von denen man erwarten würde, dass sie verformbarer/komprimierbarer sind als geschlossene Mikrotubuli. Vor der Entwicklung des Kryo-FIB-Fräsens erforderten Elektronenmikroskopie und Tomographieanalyse des Konoids eine Detergensextraktion der Parasitenmembran und/oder eine Zellabflachung, was häufig zu strukturellen Artefakten während der Probenvorbereitung und der Bildverarbeitung führte, bei denen eine Orientierungsverzerrung eine ordnungsgemäße Funktion verhinderte Korrektur fehlender Keile (Ergänzende Abbildung 2a – f, i). Unsere Daten des ungestörten, nativen apikalen Komplexes ermöglichen es uns, Veränderungen der konoiden Ultrastruktur während verschiedener Funktionszustände eindeutig zu untersuchen.

Wir wollten daher beurteilen, ob sich die Konoidbewegungen nach dem federähnlichen Modell verhielten, das die Verformung des Konoids und der Konoidfasern beinhaltet. Wir kamen zu dem Schluss, dass jede grobe ultrastrukturelle Änderung der Konformation des Konoidpolymers zu Änderungen der Gesamtabmessungen und Architekturen des Konoids führen würde. Wir verglichen die Abmessungen hervorstehender und zurückgezogener Konoide in Tomogrammen von kryo-FIB-gemahlenem N. caninum (Abb. 3 und ergänzende Abb. 5). Weder die apikalen Konoiddurchmesser (244 ± 19 nm hervorstehend vs. 236 ± 8 nm eingefahren), die Basaldurchmesser (350 ± 25 nm vs. 326 ± 7 nm) noch die Konoidhöhen (277 ± 5 nm vs. 262 ± 13). nm) unterschieden sich signifikant zwischen den beiden Staaten (Abb. 3e und ergänzende Abb. 5a). Ebenso waren der Winkel der Konoidfasern relativ zu den PCRs und die Abstände zwischen benachbarten Konoidfasern in den beiden Zuständen nicht zu unterscheiden (Abb. 3f – i). Darüber hinaus unterschieden sich sowohl die mittlere Länge der Konoidfasern als auch die Längenverteilung in der Population nicht signifikant zwischen dem hervorstehenden und dem zurückgezogenen Zustand (399 ± 37 nm gegenüber 405 ± 45 nm; ergänzende Abbildung 6a).

a–d' Tomographische Schnitte durch die Mitte des apikalen Komplexes zeigen das Konoid im hervorstehenden (a) und zurückgezogenen (b) Zustand. Weiße Linien zeigen die Maße des apikalen Durchmessers (a), des basalen Durchmessers (b) und der Höhe (h) der konoiden Struktur an. Weiße Kästchen in (a, b) zeigen die in (c, d) vergrößerten Bereiche an, in denen das Konoid und der APR-assoziierte Komplex interagieren; (c' und d') sind die pseudofarbenen Versionen von (c und d), gefärbt wie in Abb. 1 dargestellt. Beachten Sie die längliche, blattartige Dichte (goldene Pfeilspitzen in a und b), die zwischen Mikronemen und ICMT im Inneren verläuft der Konoid. IMC-„Spacer“-Dichten sind in (a, c) mit cyanfarbenen Pfeilspitzen gekennzeichnet. e Messungen des apikalen Durchmessers, des Basaldurchmessers und der Höhe der hervorstehenden (n = 3 Tomogramme, weiße Balken) und zurückgezogenen (n = 3 Tomogramme, graue Balken) Konoide zeigen keine signifikanten Veränderungen während der Zyklen der Protrusion und Retraktion. f–i Tomographische Schnitte (f, g) durch die Kante rekonstruierter Konoide (zeigt die Konoidfasern im Längsschnitt) im hervorstehenden (f) und zurückgezogenen (g) Zustand. Die Linien zeigen die Messung des relativen Winkels zwischen den CFs und der PCR-Ebene (n = 14 Messungen für den hervorstehenden und 13 Messungen für die zurückgezogenen Zustände, rote Linien) und die Messung des Abstands zwischen benachbarten CFs (n = 24 Messungen für). die hervorstehenden und 18 Messungen für die eingefahrenen Zustände, blaue Linien); Die Ergebnisse der letztgenannten Messungen für hervorstehende und zurückgezogene Konoide sind in (h) bzw. (i) dargestellt. j–m Tomographische Schnitte zeigen repräsentative PCRs (j und m) und APRs (k ​​und l) in Querschnittsansichten des apikalen Komplexes im hervorstehenden (j, k) und zurückgezogenen (l, m) Zustand. Die Durchmesser von APRs und PCRs werden als Bereiche aller verfügbaren Tomogramme angegeben (n = 3 für APRs in beiden Staaten; n = 3 hervorstehende PCRs; n = 2 zurückgezogene PCRs). Maßstabsbalken: 100 nm (in a, b, j–m); 50 nm (in c, d, f, g). Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen Student-t-Test berechnet. ns nicht signifikant (p > 0,05).

Während sich die apikale Spitze des Konoids und die PCRs bei zurückgezogenem Konoid auf Höhe des APR befinden, befindet sich nach einer Streckung des Konoids die Basis des Konoids im Bereich des APR (vgl. Abb. 3a, c, c). ' mit 3b, d, d'). Beim Wechsel zwischen dem hervorstehenden und dem zurückgezogenen Zustand ändern die apikalen IMC-Regionen, das AAD und die APRs alle ihre Position relativ zum Konoid und den damit verbundenen PCRs sowie zur Plasmamembran (Abb. 3a – d'). Die Positionen der APRs und AAD scheinen in unseren Tomogrammen eng mit dem apikalen Rand des IMC verbunden zu sein, der sich im hervorstehenden Zustand apikal zu biegen scheint. Wir fragten daher, ob die APRs strukturelle Veränderungen aufwiesen, die mit dem Vorstehen und Zurückziehen des Konoids korrelierten. Wir haben die Durchmesser der APRs in jedem unserer Tomogramme gemessen und festgestellt, dass der APR-Durchmesser im hervorstehenden gegenüber dem zurückgezogenen Zustand deutlich um 10–30 % zunahm (Abb. 3k, l und ergänzende Abb. 5b). Im Gegensatz zu den APRs zeigte die Struktur der PCRs und des Konoids keine erkennbaren Unterschiede zwischen den beiden Zuständen (Abb. 3j, m und ergänzende Abb. 5c).

Als nächstes beurteilten wir die Konoidfaserstruktur mit einer höheren Auflösung, indem wir separate Subtomogramm-Durchschnittswerte der Konoidfasern aus dem hervorstehenden (Abb. 4a; ~3,0 nm Auflösung bei 0,5 FSC, siehe ergänzende Abb. 6b) und dem zurückgezogenen Zustand (Abb. 4b; ~3,2 nm Auflösung bei 0,5 FSC, siehe ergänzende Abbildung 6b). Visuell erscheinen die Subtomogramm-Durchschnitte der Konoidfasern aus beiden Zuständen weitgehend nicht zu unterscheiden und zeigen die neun Tubulin-Protofilamente5 sowie unterschiedliche Proteindichten, die die Fasern schmücken (Abb. 4a, b). Um Abweichungen zwischen den beiden Zuständen besser beurteilen zu können, haben wir Tubulin-Dimere mit Chimera44 (Abb. 4c, d) mit Korrelationskoeffizienten von ~ 0,9 in die beiden gemittelten Kryo-ET-Karten eingepasst. Anschließend überlagerten wir die am besten passenden Modelle einer einzelnen Wiederholung der Konoidfaser aus jedem Zustand (Abb. 4e). In Übereinstimmung mit dem fehlenden Unterschied zwischen der Form der gesamten Konoidstruktur zwischen den beiden Zuständen (Abb. 3) scheint jede der neun Protofilament-Untereinheiten innerhalb der Auflösung der Daten und des Anpassungsfehlers nicht unterscheidbar zwischen den beiden Zuständen positioniert zu sein (Abb . 4e). Beachten Sie, dass die drei Protofilament-Untereinheiten mit dem höchsten RMSD in ihrer Überlagerung (PF5-7; ergänzende Abbildung 6c) in einem Bereich mit niedrigerer Auflösung der Durchschnittswerte eingepasst sind.

a, b Tomographische Querschnittsschnitte der gemittelten 8-nm-Wiederholungen der CF-Fasern im hervorstehenden (a) und zurückgezogenen (b) Zustand. c–e Die hochauflösende Struktur von Tubulin wurde in die Subtomogramm-Mittelwerte des hervorstehenden (c, blau) und des zurückgezogenen (d, rosa) Zustands eingepasst. Der Vergleich (e) der beiden pseudoatomaren Protofilamentmodelle im hervorstehenden (blau) und zurückgezogenen (rosa) Zustand zeigt keinen signifikanten Unterschied. f Längsansichten des pseudoatomaren Protofilamentmodells im eingefahrenen Zustand. Die Steigung wurde basierend auf dem Anstieg der periodischen CF-assoziierten MAPs zwischen benachbarten Protofilamenten geschätzt. g Die Isoflächendarstellung der schön gefalteten gemittelten Protofilamente zeigt eine „Schiefe im Uhrzeigersinn“, wenn man sie von der Konoidbasis aus betrachtet, was darauf hindeutet, dass die Minusenden der Konoidfasern zur Basis ausgerichtet sind. h Die Anordnungen der modellierten Protofilamente in den CFs (rosa) im Vergleich zur hochauflösenden Kryo-EM-Struktur der typischen subpellikulären Mikrotubuli mit 13 Protofilamenten (grün; EMDB: EMD-23870). Der wesentlichste Unterschied ist die Winkeländerung zwischen PF4 und PF5, die zu einem engen Knick in der Protofilamentanordnung führt. i–k Tomographische Schnitte der globalen Mittelwerte des CF-Subtomogramms, die alle Daten sowohl aus dem hervorstehenden (a) als auch dem eingefahrenen (b) Zustand kombinieren, betrachtet im Querschnitt (i: Original; i': pseudofarbig) und in Längsrichtung (j und). k) Orientierungen. Die weißen Linien in (i) zeigen die Positionen der Scheiben in den jeweiligen Panels an. Beschriftungen und Farbgebung siehe unten. l–o-Isoflächen-Renderings zeigen die 3D-Strukturen der gemittelten CF-Wiederholungen in Querschnitts- (l) und Längsansichten (m) sowie die CFs eines vollständigen Konoids (n), indem die gemittelten 8-nm-Wiederholungen wieder zusammengesetzt werden das vollständige Tomogramm. Dies und die Vergrößerung (o) zeigen, dass die offene Fläche der C-förmigen CFs zum Inneren des Konoids zeigt. Beschriftung und Färbung: 1–9, Protofilamente; IA (blau) und OA (rosa) „Innenschichtarm“- und „Außenschichtarm“-Dichten, IJ (gelb) innere Verbindung, MAP; MAP1 (orange), MAP2 (magenta), MAP4 (grün), Mikrotubuli-assoziierte Proteine. Maßstabsbalken: 10 nm (in a, b, i–k).

Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass sich das Konoid beim Vor- und Zurückziehen scheinbar wie ein starrer Körper bewegt und nicht wie eine konformationell verformbare Struktur, und dass es während dieses Prozesses zu keiner offensichtlichen Neuanordnung der Protofilamente innerhalb der Konoidfasern kommt. Aufgrund dieser Daten können wir jedoch geringfügige Konformationsänderungen zwischen den beiden Zuständen nicht ausschließen. Unsere In-situ-Daten bestätigen auch, dass die konoiden Fasern eine ungewöhnliche offene C-förmige Anordnung von neun Protofilamenten5 bilden, die Kontakte erfordern, die sich von einem typischen 13-Protofilament-MT unterscheiden (Abb. 4h).

Nachdem wir gezeigt haben, dass die Konoidfasern zwischen dem hervorstehenden und dem zurückgezogenen Zustand keine größeren Konformationsänderungen erfahren, haben wir Partikel aus beiden Zuständen kombiniert, um einen globalen Durchschnitt der Konoidfasern zu berechnen (Abb. 4i – k). Der resultierende Durchschnitt der beiden Zustände zeigt ein deutlich verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis und eine Auflösung von ~2,8 nm beim 0,5-FSC-Kriterium (oder ~2,2 nm beim 0,143-FSC-Kriterium; ergänzende Abbildung 6b) und zeigt beides eine Dichtebeschichtung die äußeren (MT-assoziierten Proteine; MAPs) und inneren (MT-inneren Proteine; MIPs) Kanten der Konoidfaser (Abb. 4i – o und Zusatzfilm 1). Die MIP-Dichten überbrücken mehrere Protofilamente und bedecken fast die gesamte Innenfläche der Konoidfaser (Abb. 4i, i'). Diese Kontakte können helfen, die scheinbare Steifheit der konoiden Faserstruktur zu erklären. Auch die Außenfläche der Konoidfasern scheint fast vollständig mit MAPs verziert zu sein (Abb. 4i – o und ergänzende Abb. 2i – k). Mit PF5-8 sind zwei Schichten von MAPs verbunden, die hier als „Innenschichtarm“- und „Außenschichtarm“-Dichten bezeichnet werden (IA und OA; Abb. 4i, j und ergänzende Abb. 2i, j). Zu den weiteren MAPs gehören MAP1, 2 und 4, die jeweils mit PF1, 2 und 4 verknüpft sind. Wir beobachten auch MAP-Dichten (IJ) am inneren Übergang, die PF3 einer konoiden Faser (n) mit PF9 der benachbarten Faser (n + 1) verbinden; Abb. 4i, i', k–o und ergänzende Abb. 2i, i' , k, 6f–h). Diese Kontakte zwischen den Fasern stabilisieren wahrscheinlich die spiralförmige Konoidstruktur und verstärken ihre Steifigkeit. Die meisten MAPs weisen eine deutliche Periodizität von 8 nm entlang der Länge der Konoidfaser auf (Abb. 4j, k, m und ergänzende Abbildungen 2j, k, 6e, e ').

Regelmäßige Mikrotubuli sind helikale Anordnungen, die eine charakteristische Händigkeit, Helixsteigung und Polarität aufweisen. Beispielsweise bildet ein typisches 13-Protofilament-Mikrotubulus ein gerades Polymer mit einem Anstieg von drei Monomeren (12 nm) pro linksgängiger Helixwindung (eine „13-3-Helix“) oder einem Anstieg von 0,92 nm pro Protofilament-zu-Protofilament-Kontakt45 . Anhand der regelmäßig beabstandeten MAPs konnten wir die Steigung der Konoidfaser in Längsansichten zuordnen (Abb. 4f, j, k und ergänzende Abb. 2j, 6e, e‘). Da die C-förmigen konischen Fasern aus offenen und nicht aus geschlossenen helikalen Mikrotubuli bestehen, haben wir nur die Steigung von Protofilament zu Protofilament berechnet. Unser Modell zeigt, dass sich die konoide Faser durch eine linksgängige Anordnung bildet – wie ein typischer Mikrotubulus, aber eine geschätzte Ganghöhe von etwa 1,5 nm Protofilament zu Protofilament aufweist, was etwa 1,6-fach größer ist als bei einem typischen Mikrotubulus (Abb. 4f). und ergänzende Abb. 6e, e'). Um die strukturelle Polarität der Konoidfaser zu bestimmen, führten wir einen neunfachen Mittelwert der Protofilamente durch (unter Verwendung der Tangente/Normalen zur C-förmigen Krümmung der Faser). Die Isoflächendarstellung der neunfach gemittelten Protofilamente zeigte von der Konoidbasis aus gesehen eine „Verzerrung im Uhrzeigersinn“, was darauf hindeutet, dass sich die Minusenden der Konoidfasern an der Basis des Konoidkomplexes befinden (Abb. 4g).

Anstelle der zuvor berichteten zwei PCRs5,9 lösen wir drei PCRs auf (Abb. 5 und ergänzende Abb. 2b, 7): P1 ist der apikalste und kleinste Ring (Abb. 5b – d, g, h und ergänzende Abb. 7e). , i) mit 151 ± 6 nm Durchmesser – was bei früheren mit Reinigungsmitteln behandelten und negativ gefärbten Proben wahrscheinlich übersehen wurde; P2 (Mitte; Abb. 5b – h und ergänzende Abb. 7f, j) besteht aus zwei Teilringen mit folgenden Durchmessern: P2a – 178 ± 2 nm, P2b – 217 ± 8 nm; und P3 (basal; Abb. 5c, d, g, h und ergänzende Abb. 7g, k) hat einen Durchmesser von 258 ± 8 nm (Abb. 5b – h). Alle Durchmesser wurden an den Außenkanten der Ringe in 4 verschiedenen Zellen gemessen (n = 4). Die Subtomogramm-Mittelung der PCR aus vier rekonstruierten N. caninum-Zellen ergab einen Auflösungsdurchschnitt von 4,9 nm (0,5 FSC-Kriterium, ergänzende Abbildung 6b) und zeigte sowohl die Periodizität als auch die Verbindungen zwischen den PCR-Schichten. In unseren Tomogrammen scheint jede der Schichten die gleiche Periodizität zu haben, mit 45–47 Untereinheiten pro Ring (Abb. 5g, h). P2 und P3 sind mit regelmäßig beabstandeten Linkern verbunden, die etwa 25 nm lang sind und eine scheinbare Brückendichte zwischen den benachbarten Linker-Untereinheiten aufweisen (Abb. 5b – d, g und ergänzende Abb. 2b, 7c).

eine Karikatur des apikalen Komplexes, die den Ort der PCRs hervorhebt. b–d Tomographische Schnitte (b und c) und Isoflächendarstellung der gemittelten PCR-Wiederholungen (d), betrachtet in tangentialer (b) und longitudinaler Ausrichtung (c und d), die verschiedene Komponenten der PCR zeigen, einschließlich des apikalen P1 (hervorgehoben). durch blaue Pfeilspitzen), P2a (Cyan), P2b (Grün), P3 (Gelb) und der Linker (Orange) zwischen P2b und P3. Die weiße Linie in (c) zeigt die Position des Schnitts in (b) an. e, f Querschnittsschnitte aus einem Rohtomogramm (e) und den gemittelten PCR-Wiederholungen (f) zeigen, dass der runde PCR-P2-Ring aus einem äußeren und einem inneren Ring, P2a bzw. P2b, besteht. Das gelbe Quadrat in (e) gibt die Ausrichtung und Position des in (f) angezeigten Subtomogramm-Durchschnitts an. g, h Isosurface-Renderings zeigen die vollständigen PCRs, indem die gemittelten Wiederholungen wieder zum vollständigen Tomogramm zusammengesetzt werden. Maßstabsbalken, 20 nm (in b, c, f); 50 nm (in e).

Konventionelle EM von chemisch fixierten und in Harz eingebetteten Apicomplexan-Parasiten hat einen grundlegenden Überblick über die Organisation der apikalen sekretorischen Organellen innerhalb des Kokzidienkonoids geliefert5,46, den wir als Leitfaden für unsere Analyse der In-situ-Struktur des apikalen Komplexes verwendet haben – einschließlich die sekretorischen Organellen – in unseren Tomogrammen (Abb. 6, 7, ergänzende Abb. 8 und ergänzender Film 1). Wir beobachten deutlich das zentrale Paar intrakonoidaler Mikrotubuli (ICMT), das sich basal von der Konoidspitze über 500–800 nm erstreckt (Abb. 6a, b und ergänzende Abb. 6i), was länger ist als die zuvor berichteten 350 nm . Man geht davon aus, dass das ICMT ein wichtiges Organisationszentrum für die Sekretion in Kokzidien ist47,48 und es scheint über eine Reihe assoziierter Proteine ​​zu verfügen, die sich sowohl von den subpellikulären Mikrotubuli als auch von den Konoidfasern unterscheiden5, obwohl bisher nur ein solches Protein identifiziert wurde49.

a, b Tomographische Schnitte zeigen die apikale Spitze einer N. caninum-Zelle mit den sekretorischen Organellen, die um den ICMT (grün) innerhalb des hervorstehenden Konoidkomplexes angeordnet sind, in Längsansichten (a, a' – hervorstehendes Original und pseudofarbig; b – zurückgezogen). ). Die langen ICMTs verbinden die Spitze des Konoids mit dem Zytosol und sind eng mit den sekretorischen Vesikeln (hellblau) und zwei Rhoptrien (rosa) lokalisiert. Beachten Sie, dass das membranassoziierte, am weitesten apikale Vesikel im tomographischen Schnitt in (a) nicht sichtbar ist, aber in den Feldern (c, d) und Abb. 7b sichtbar ist. Andere Färbungen: CFs (orange), Mikroneme (dunkelblau), blattartige Dichte (gold), intervesikuläre Verbindungen (rosa), „krönende“ Dichte, die das apikale Minus-Ende des ICMT abdeckt (lila). c–e 3D-Segmentierung und Visualisierung der in (a bzw. b) gezeigten Tomogramme, d. h. mit hervorstehendem (c, d) und zurückgezogenem (e) Konoid, die die Gesamtorganisation der sekretorischen Organellen innerhalb des Konoidkomplexes, einschließlich CFs, zeigen ( von vorne beschnitten, um den Inhalt im Inneren zu zeigen), Mikroneme, Rhoptrien, ICMT, Vesikel, intervesikuläre Verbindungen, blattartige Struktur entlang von Mikronemen und Plasmamembran (grau). d zeigt eine Vergrößerung von (c), wobei die konischen Fasern der Übersichtlichkeit halber ausgeblendet sind. f, g Querschnittsschnitte durch die hervorstehenden (f, f' – ursprünglich und pseudofarbig) und zurückgezogenen (g) Konoide aus den in (a und b) gezeigten Tomogrammen. Maßstabsbalken: 100 nm (in a, b); 50 nm (in f, g).

a–c' Tomographische Schnitte (a–c: Original; a'–c': pseudofarbig) zeigen: (a, a') fünf regelmäßig beabstandete Vesikel (hellblau), von denen vier entlang eines der Mikrotubuli verlaufen des ICMT (hellgrün) und durch intervesikuläre Linker (rosa) verbunden; (b, b') ein Rhoptry (Rose), das mit der Plasmamembran (PM) über das am weitesten apikale Vesikel (hellblau) und den „Rosetten“-Andockkomplex (gelb) interagiert; und (c, c') ein spiralförmiges Gerüst (dunkles Rosa), das mit der Rhoptry-Membran im Rhoptry-Halsbereich verbunden ist. d, e Die Schnitte des Subtomogramms ergaben durchschnittlich 8-nm-Wiederholungen der ICMTs, betrachtet im Querschnitt (d) und in Längsrichtung (e). f Gelegentlich wurden im ICMT-Komplex mehr als zwei Mikrotubuli beobachtet. Hier ist ein Beispiel für drei Mikrotubuli (weiße Pfeilspitzen) dargestellt. g Dreizehnfach rotationsgemittelte ICMT aus 53 Subtomogrammen von mit Detergenz extrahierten Toxoplasma-Zellen. Die Pfeile zeigen die Schrägstellung der Protofilamente im Uhrzeigersinn, wenn die ICMT von apikal nach basal betrachtet werden, was darauf hinweist, dass die Minusenden der ICMTs im Parasiten apikal ausgerichtet sind. h, h' Die basalen Enden der ICMTs zeigten ausgestellte Enden und unterschiedliche Längen von Protofilamenten, was normalerweise mit dynamischen Plus-Enden von MTs verbunden ist. i Ein tomographischer Schnitt eines hervorstehenden Konoids zeigt die Organisation von Mikronemen. Einfügung: Der Subtomogramm-Durchschnitt der apikalen Spitzen von 25 Mikronemen zeigt eine abgeflachte, elektronendichte Kappe. j, k Tomographische Schnitte bieten eine seitliche (j) und eine obere Querschnittsansicht (k) von zwei sekretorischen Organellen, einem Mikronem (M) und einem Rhoptrie-assoziierten Vesikel (V), die nebeneinander angedockt sind die Plasmamembran (das Vesikel durch die Rosette (Ro)), jedoch mit deutlichen Andockstellen (44 nm voneinander entfernt). Beachten Sie, dass beide Organellen an denselben in der Plasmamembran verankerten Grat (gelbe Pfeile) gebunden sind (rosa und blaue Pfeile). Die weiße Linie in (j) zeigt die Position des Schnitts in (k) an. Maßstabsbalken: 100 nm (in I); 50 nm (in a–c, f, h, j, k); 20 nm (in i einfügen), 10 nm (in d, e, g).

In Übereinstimmung mit dem, was mit EM von in Harz eingebetteten Proben beobachtet wurde5, beobachten wir, dass sich in Tomogrammen sowohl von hervorstehenden als auch von zurückgezogenen Konoiden unterschiedliche sekretorische Organellen (die Rhoptrien und Mikroneme) auf gegenüberliegenden Seiten des ICMT absondern (Abb. 6). Wir beobachteten auch vier bis sechs regelmäßig beabstandete Vesikel, die sich entlang eines der Mikrotubuli des ICMT bewegten (Abb. 6a – e, 7a, a'), was mit früheren Berichten übereinstimmt 26, 46. Wir beobachteten ein einzelnes Vesikel knapp apikal des ICMT, das an die Dichte der kürzlich beschriebenen „Rosette“ angedockt zu sein scheint (Abb. 7b-b‘) und mit der Erleichterung der Rhoptry-Sekretion in Verbindung gebracht wurde26. In Übereinstimmung mit dieser Funktion beobachten wir, dass das am weitesten apikale, an der Membran angedockte Vesikel mit den apikalen Spitzen von ein bis zwei Rhoptrien verbunden ist (Abb. 7b, b' und ergänzende Abb. 8a). Wir identifizierten auch klare Dichten, die die Vesikel sowohl mit dem ICMT als auch untereinander innerhalb einer Kette verbinden (Abb. 6a–e, 7a). Bemerkenswert ist, dass wir diese Brückendichte am apikalen, an der Membran angedockten Vesikel nicht beobachteten (Abb. 7a; n = 6 Tomogramme mit der Vesikelkette und dem apikalen Vesikel vorhanden; beachten Sie, dass in anderen Tomogrammen das apikale Vesikel durch Kryotherapie weggefräst wurde). FLUNKEREI). Während das apikale Vesikel wahrscheinlich aus der ICMT-assoziierten Vesikelkette stammt, scheint es beim Andocken an die Rhoptrie und die Plasmamembran von der Vesikelkette und ihren Verbindungen gelöst worden zu sein. Wir haben auch beobachtet, dass einige der Vesikel entlang der ICMT-Achse verlängert erscheinen, was darauf hindeutet, dass sie unter Spannung stehen und beim aktiven Transport entlang der ICMT eingefangen wurden (Abb. 6a).

Eine Parasitenzelle verfügt über ca. 10 Rhoptrien und Dutzende Mikroneme, obwohl jeweils nur eine Teilmenge beider Organellen am Parasitenkonoid angedockt ist46. In allen Tomogrammen, die den vollen Durchmesser des Parasitenkonoids enthielten (6 von 9 Tomogrammen), beobachteten wir zwei Rhoptrien entlang der ICMT, jedoch auf gegenüberliegenden Seiten der ICMT (Abb. 6c – g; farbige Rose). Wir beobachten jedoch keine eindeutigen Linker, die die Rhoptrien mit dem ICMT verbinden. Im apikalen Bereich des Parasiten verläuft eine spiralförmige Dichte korkenzieherförmig entlang der Rhoptry-Membranen (Abb. 7b – c'), die an das Lokalisierungsmuster von Ferlin-2 erinnert, das durch Immun-EM50 beobachtet wurde. Die Filamente, die die Rhoptrien innerhalb des Konoids spiralförmig nach oben winden, hatten zuvor anhand von Tomogrammen ungemahlener Proben, in denen die Parasiten aufgrund der Oberflächenspannung abgeflacht waren, einen Durchmesser von etwa 33 nm und eine Ganghöhe von etwa 21,5 nm geschätzt51. Wir fanden heraus, dass eine solche vorhergesagte Helix mit unseren Messungen von ~36 nm Durchmesser und ~17 nm Ganghöhe von kryo-FIB-gemahlenen Parasiten übereinstimmt (Abb. 7c, c').

Aufgrund ihrer kurzen Länge und der möglichen Variation der zugehörigen Proteine ​​entlang ihrer Länge ergab die Subtomogramm-Mittelung der ICMT keine ausreichende Auflösung, um MAPs oder MIPs eindeutig aufzulösen (Abb. 7d, e). Stattdessen untersuchten wir die Chiralität des ICMT-Querschnitts52 anhand eines ICMT-Subtomogramm-Durchschnitts aus einem Detergens-extrahierten Tomogramm (Abb. 7g). Diese Analyse zeigt, dass die Minusenden beider gepaarter ICMT im Gegensatz zu den Konoidfasern apikal ausgerichtet sind. Darüber hinaus weist das basale Plus-Ende des ICMT-Paares die für dynamische Mikrotubuli typische gespreizte Morphologie auf (Abb. 7h). Diese Beobachtung legt nahe, dass die ICMT im Gegensatz zu den meisten anderen apikomplexen MT-Strukturen an ihrem Plus-Ende eine dynamische Instabilität aufweist (Abb. 7h) und könnte erklären, warum die zuvor gemeldeten ICMT-Längen zwischen den Proben stark variieren und in extrahierten Proben5 im Vergleich zu diesen durchweg kürzer sind die wir anhand intakter, einheimischer Parasiten messen. Wir beobachten auch eine Dichte, die das apikale Minus-Ende des ICMT abdeckt (Abb. 6a, b), was mit einem Mikrotubuli-organisierenden Zentrum übereinstimmt, von dem aus das ICMT polymerisiert. Bei Kokzidien scheint γ-Tubulin jedoch auf die Zentriolen und das Zytoplasma des Parasiten beschränkt zu sein und wurde nicht im apikalen Komplex lokalisiert53. Wie bereits berichtet46, enthielten einige ICMT einen dritten Mikrotubulus (Abb. 7f), was darauf hindeutet, dass eine strenge Kontrolle der Struktur für ihre Funktion nicht erforderlich ist.

Bemerkenswerterweise trennen sich das ICMT und die damit verbundenen Vesikel und Rhoptrien auf einer Seite des Konoids, die sich von der von den Mikronemen besetzten Region unterscheidet (Abb. 6c – g); Daher ist das ICMT nicht direkt an der Organisation von Mikronemen für die Sekretion beteiligt. Dennoch wirken die Mikroneme nicht unorganisiert (Abb. 6c–e; 7i). Stattdessen sind sie in Clustern angeordnet und weisen eine ausgeprägte polarisierte Ausrichtung auf. Die Mikroneme sind relativ gleichmäßig in Länge (220 ± 30 nm) und Breite (58 ± 11 nm; ergänzende Abbildung 8b – h) und die basalen Enden sind abgerundet, während die apikalen Enden schmal mit einer abgeflachten, elektronendichten Kappe erscheinen (Abb. 7i; Einschub). Diese Dichte lässt auf einen unbeschriebenen Gerüstkomplex schließen, der unserer Meinung nach die Mikroneme organisiert und bei ihrem Handel hilft. Darüber hinaus beobachteten wir in einem Tomogramm eines zurückgezogenen Konoids zwei Mikroneme, die anscheinend über ihre apikalen Spitzen an die Plasmamembran angedockt waren (ergänzende Abbildung 8i). Darüber hinaus haben wir in unseren Tomogrammen durchweg eine lange blattförmige Dichte zwischen den Mikronemen und dem ICMT festgestellt (Abb. 6a, b und Zusatzfilm 1). Die Dicke der Schicht variiert zwischen etwa 4 und 8 nm, sie erscheint faserig, ist etwa 15 bis 30 nm breit und erstreckt sich oft von der Oberseite des Konoids bis unter seine Basis. Diese Daten legen nahe, dass die blattartige Struktur bei der Organisation und dem Transport sekretorischer Organellen hilfreich sein könnte.

Während Mikroneme kontinuierlich sezernieren, um die Beweglichkeit extrazellulärer Parasiten zu fördern, sind sie auch eng an der Auslösung der Invasion der Wirtszellen beteiligt. Um eine Invasion einer Wirtszelle einzuleiten, sind alle Apicomplexan-Parasiten auf die Sekretion eines Rezeptor/Co-Rezeptor-Paares angewiesen, das ein Mikronem-Protein (AMA1) und ein Rhoptry-Protein (RON2) umfasst54,55. Es wurde vorgeschlagen, dass sich Mikroneme- und Rhoptry-Komponenten des Invasionsapparats vermischen, da sie über einen gemeinsamen Weg am Konoid abgesondert werden23. Dass wir Mikronemen getrennt von den angedockten Rhoptrien beobachten, stellt dieses Modell in Frage. Darüber hinaus haben wir in einem Tomogramm eines hervorstehenden Konoids ein Mikronem identifiziert, das offenbar beim Andocken/Sekretieren der Plasmamembran eingefangen wurde (Abb. 7j, k und ergänzende Abb. 8j – m). In Übereinstimmung mit einem laufenden Sekretionsereignis ist das betreffende Mikronem etwa halb so lang wie alle anderen gemessenen Mikroneme (ergänzende Abbildung 8h, rote Datenpunkte). Wir beobachten eine Dichte, die mit einer großen oder mehreren Kontaktstellen in einem kreisförmigen Bereich von ~ 85 nm Durchmesser übereinstimmt (Abb. 7k und ergänzende Abb. 8j, l). Wir beobachten auch einen offensichtlichen Dichtebolus auf der Oberfläche der Plasmamembran, der mit der Kontaktstelle verbunden ist (Abb. 7j und ergänzende Abb. 8j, m), was mit der Sekretion von Mikroneminhalten übereinstimmt. Bemerkenswert ist, dass die Andockstelle dieses sezernierenden Mikronemes 44 nm von der Rosette und ihrem angedockten Rhoptry/apikalen Vesikel entfernt ist, was darauf hindeutet, dass die beiden Organellen an unterschiedlichen Stellen sezernieren und dabei unterschiedliche sekretorische Mechanismen nutzen (Abb. 7j). Allerdings sind sowohl das Rhoptry-assoziierte Vesikel als auch das angedockte Mikronem an denselben Grat (Abb. 7j, k und ergänzende Abb. 8j; gelbe Pfeile) und Membrananker (ergänzende Abb. 8m und Einschub; gelbe Pfeilspitzen) gebunden würde wahrscheinlich die räumliche und zeitliche Koordination der Sekretion erleichtern.

Die konoide Struktur des apikalen Komplexes hat seit seinen frühesten Beschreibungen durch konventionelle TEM56,57 die Fantasie von Mikroskopikern angeregt. Hier haben wir Kryo-ET auf kryo-FIB-gemahlene Parasiten angewendet, um die nativen In-situ-Strukturen des Zytoskeletts des apikalen Kokzidienkomplexes und der damit verbundenen sekretorischen Organellen im hervorstehenden und zurückgezogenen Zustand des Konoids zu vergleichen. Ein konoider Vorsprung ist mit auffälligen morphologischen Veränderungen an der apikalen Spitze des Parasiten verbunden, die durch Lichtmikroskopie sichtbar sind6,58. Diese morphologischen Veränderungen, gepaart mit der ungewöhnlichen Spiralform des Konoids, haben zu dem Modell geführt, dass der Konoid federartig ist und sich während seiner Bewegungen (Vorstehen/Zurückziehen) verformt. Frühere Kryo-EMs von durch Waschmittel extrahierten Parasiten59 und eine kürzlich veröffentlichte Kryo-ET-Analyse35 dokumentieren Unterschiede zwischen hervorstehenden und zurückgezogenen Konoiden. Die Subtomogramm-Mittelung im Sun et al. Die Studie konzentrierte sich auf mit Reinigungsmitteln extrahierte Proben, und die in beiden vorherigen Analysen verwendeten Proben waren komprimiert, was zu strukturellen Artefakten führen kann.

Im Gegensatz dazu bewahren unsere mit Kryo-FIB gemahlenen Proben die Zirkularität der Struktur des apikalen Kokzidienkomplexes (ergänzende Abbildung 2g, h und ergänzender Film 1), was eine zuverlässigere Abfrage seiner nativen Struktur ermöglicht. Unsere Daten zeigen, dass sowohl die Ultrastruktur als auch die molekulare Organisation des hervorstehenden und zurückgezogenen Zustands des Konoids nicht zu unterscheiden sind, was darauf hindeutet, dass sich die Fasern des Konoids bei Bewegungen des Konoids nicht wie eine Feder verformen und daher keine Energie liefern, um die Bewegung des Konoids oder die Bewegung des Konoids zu unterstützen Sekretion.

Während wir keine Veränderungen in der Struktur des zurückgezogenen gegenüber dem hervorstehenden Konoid beobachteten, stellten wir fest, dass sich der APR während der Protrusion zu erweitern scheint, was mit einer Flexion des IMC an der apikalen Spitze während der Protrusion verbunden zu sein scheint. Wir haben auch keine engen Kontakte zwischen dem Konoid und dem APR beobachtet, vielmehr erscheint der hervorstehende Konoid oft etwas geneigt relativ zur APR-Ebene, was mit flexiblen und/oder dynamischen Bändern übereinstimmt, die den Konoid mit dem APR und/oder dem apikalen Rand des APR verbinden IMC. RNG2 scheint ein solches Protein zu sein, da sich seine N- und C-Termini während der Protrusion zwischen dem Konoid und dem APR zu erstrecken scheinen60. Obwohl wir nicht erwarten würden, die Dichte eines solchen intrinsisch ungeordneten Proteins zu ermitteln, beobachteten wir Dichten, die sich zwischen der Basis des hervorstehenden Konoids und dem APR erstreckten und mit Aktin/Aktin-ähnlichen Filamenten übereinstimmten. Daher ist es möglich, dass die Aktinpolymerisation an dieser Stelle zumindest teilweise für die Erzeugung der Kraft der Konoidbewegung verantwortlich ist. Bemerkenswerterweise ergab eine frühe Beschreibung der Konoidprotrusion, dass die Depolymerisation von Aktin mit Cytochalasin D die Konoidprotrusion abschwächte, aber nicht vollständig aufhob6. Kürzlich wurde gezeigt, dass Formin-1, das für die Polymerisation von Aktin am Konoid verantwortlich ist, für die Konoidprotrusion von wesentlicher Bedeutung ist61. Dennoch sind weitere hochauflösende Strukturstudien unter Verwendung genetischer Störungen erforderlich, um einzelne Proteine ​​im apikalen Komplex zu platzieren und die physikalischen Grundlagen der Dynamik und Funktion des Konoids zu entschlüsseln.

Da unsere mit Kryo-FIB gemahlenen Proben die Parasitenmembranen konservierten, erhielten wir einen beispiellosen Einblick in die Wechselwirkungen zwischen dem Zytoskelett des apikalen Komplexes und den spezialisierten sekretorischen Organellen des Parasiten. Wir beobachteten enge Kontakte zwischen dem ICMT und sowohl den Rhoptrien des Parasiten als auch der apikalen Vesikelkette. Dies deutet darauf hin, dass die ICMT für die Organisation dieser Organellen verantwortlich sind, nicht jedoch die Mikroneme, mit denen wir keine direkten Kontakte beobachtet haben. Während die ICMT in Apicomplexa außerhalb von Eucoccidiorida nicht allgemein konserviert sind, wurde interessanterweise über ein ICMT-Paar in Chromera velia15 berichtet, einem frei lebenden Alveolat, das zu den vorhandenen Organismen gehört, die am engsten mit Apicomplexa verwandt sind (ergänzende Abbildung 1). Somit waren die ICMT wahrscheinlich in den Vorfahrenarten vorhanden. Dass sich die apikalen Vesikel und Rhoptrien entlang der ICMT bewegen, deutet darauf hin, dass ein Mikrotubuli-Motor ihre Organisation erleichtern könnte, obwohl Kinesine und Dyneine der Parasiten nicht in der ICMT lokalisiert wurden. Da der Großteil des Handels mit Apicomplexa offenbar über Aktinfilamente erfolgt3,62,63,64, wurden die Mikrotubuli-Motoren des Parasiten noch nicht systematisch charakterisiert. Bemerkenswerterweise wurde bisher nur ein einziges ICMT-lokalisiertes Protein identifiziert,49 dem es an klarer Homologie zu bekannten Strukturen mangelt.

Eine wichtige offene Frage auf diesem Gebiet ist die molekulare Grundlage der Kraft, die die Sekretion der am apikalen Komplex angedockten, mit der Invasion verbundenen Organellen antreibt. Die Rhoptrien sind > 1 μm lang und erfordern wahrscheinlich eine kompliziertere Maschinerie als das einfache Andocken der Membran, um die Sekretion voranzutreiben. Interessanterweise blockiert die Depolymerisation von Aktin unter Verwendung von Cytochalasin D die Parasitenmotilität und -invasion, nicht jedoch die Anheftung an Wirtszellen und die Rhoptry-Sekretion65, was darauf hindeutet, dass Aktin nicht für die Steuerung der Sekretion verantwortlich ist. Neuere Arbeiten identifizierten die Apicomplexan-Nd-Proteine, aus denen die „apikalen Rosetten“ bestehen, Strukturen, die in der Ciliatengruppe der Alveolata am besten charakterisiert sind27. Ähnlich wie ihre Rolle bei Ciliaten sind die Apicomplexan-Nd-Proteine ​​für die Rhoptry-Sekretion26 essentiell, und die Rosettenstruktur wurde kürzlich mithilfe von Kryo-ET von ungemahlenen Parasiten51 beschrieben. Das Toxoplasma-Protein Ferlin-2 ist auch für die Sekretion der Rhoptrien erforderlich50, und wir und andere51 identifizierten eine spiralförmige Dichte um die Rhoptrien innerhalb des Konoids, die an das veröffentlichte Ferlin-2-Immun-EM-Färbungsmuster erinnert50. Diese spiralförmigen Filamente können wie Dynamin wirken und die Rhoptrien während der Sekretion zusammendrücken. Unter den Toxoplasma Nd-assoziierten Proteinen befanden sich mutmaßliche GTPase-verwandte Proteine26, was darauf hindeutet, dass an dieser Stelle ebenfalls eine Dynamin-ähnliche Aktivität vorhanden sein könnte.

Mit der Fähigkeit, hochdynamische zelluläre Prozesse schnell einzufrieren und so Momentaufnahmen zu machen, konnten wir ein angedocktes Mikronem beobachten, das sich offenbar im Sekretionsvorgang befindet. Wir fanden heraus, dass sich der Ort der Sekretion von Mikronemen von dem eines angedockten Rhoptry-assoziierten Vesikels unterscheidet, was darauf hindeutet, dass die Komponenten der von diesen beiden Organellen sezernierten Invasionsmaschinerie sich nach der Sekretion in der apikalen Plasmamembran wiederfinden müssen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Sekretion von Mikronemen während der Konoidprotrusion erfolgen kann, Ereignisse, die durch andere Studien indirekt in Zusammenhang gebracht wurden7. Beachten Sie jedoch, dass diese Daten eine zusätzliche Sekretion im zurückgezogenen Zustand nicht ausschließen. Schließlich beobachteten wir nicht nur einen mit der Plasmamembran verbundenen Grat und Anker zwischen dem angedockten Mikronem und dem Rhoptry-assoziierten Vesikel, sondern auch eine längliche (faserige) Schicht, die zwischen den Mikronemen und dem ICMT verläuft. Diese Strukturen können Zytoskelettelemente darstellen, die für die Organisation, den Transport und das koordinierte Andocken der apikalen sekretorischen Organellen an der Membran verantwortlich sind. Der Umsatz von Mikronemen erfordert den Transport entlang von Aktin, obwohl Biogenese und Organisation von Mikronemen aktinunabhängig zu sein scheinen63. Weitere Studien sind erforderlich, um die molekularen Komponenten von Anker, Grat und Blatt sowie ihre Funktionen beim Transport und der Sekretion von Organellen zu identifizieren.

Zusammenfassend hat uns die Kryo-ET von kryo-FIB-gemahlenen Parasiten ermöglicht, den apikalen Komplex in situ zu untersuchen und so die Kompressionsartefakte zu überwinden, die bei der Vorbereitung intakter Zellen in einer dünnen Eisschicht auftreten. Diese bedeutenden Fortschritte ermöglichten es uns, die natürliche Struktur des Konoidkomplexes und seine Bewegungen beim Zurückziehen und Vorstehen zu untersuchen. Wir konnten eindeutig nachweisen, dass sich das Konoid während der Protrusion als starrer Körper bewegt, mit filamentösen, aktinähnlichen Vorsprüngen, die es mit dem APR verbinden. Die nächste Grenze beim Verständnis der Mechanismen des apikalen Komplexes wird das Einfangen von Parasiten während der Invasion der Wirtszellen sein. Es ist möglich, dass Komponenten des apikalen Komplexes eine gewisse Konformationsänderung erfahren, wenn der Parasit in engem Kontakt mit der Membran einer Wirtszelle steht. Wir gehen auch davon aus, dass weitere Studien, die proteomische Daten mit Kryo-ET von kryo-FIB-gemahlenen Parasiten kombinieren, die Platzierung einzelner Proteine ​​in der apikalen komplexen Struktur ermöglichen werden, was neues Licht auf die molekularen und strukturellen Grundlagen ihrer Bewegungen und Funktionen werfen wird.

Der phylogenetische Baum in der ergänzenden Abbildung 1 wurde in RAxMLv8.266 unter Verwendung des LG-Substitutionsmodells mit Gammaratenheterogenität und empirischen Häufigkeiten mit 1000 Bootstrap unter Verwendung eines Alignments der Proteinsequenzen für HSP90, verkettet mit RPS11, geschätzt (Zugriffe: AFC36923.1, BESB_021480, XP_029219085.1, LOC34617734, XP_022591029.1, ETH2_0701200, ETH2_0910900, NCLIV_040880, XP_003884203.1, TGME49_288380, XP_002366350.1, SN3_030000 05, SN3_01300510, PBANKA_0805700, XP_034421046.1, PF3D7_0708400, XP_001351246.1, PVP01_0108700, PVP01_0822500, GNI_014030, XP_011128490. 1, KVP17_001483, KAH0483594.1, FG379_001268, KAH7649672.1, Chro.30427, OLQ16118.1, cgd3_3770, CPATCC_001922, Vbra_12473, CEM00719.1, Cvel_2184, Cvel _482, AAA30132.1, XP_764864.1, XP_952473.1, XP_952423. 1, XP_001611554.1, XP_001609980.1, XP_002775585.1, XP_002766754.1, XP_001447795.1, XP_001445466.1, XP_001009780.1, XP_001030186.1, AAR27544 .1, XP_009040431.1, XP_009033899.1).

Menschliche Vorhautfibroblasten (HFF; ein Geschenk von John Boothroyd) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 2 mM Glutamin, gezüchtet. Toxoplasma gondii (Stamm RH) und Tachyzoiten von Neospora caninum (Stamm NC1) wurden in konfluenten Monoschichten von HFF gehalten. Mit Reinigungsmittel extrahierte Toxoplasma-Zellen und die zugehörigen Subtomogramm-Durchschnittswerte sind in Abb. 7g und den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 2a–f, i–k, 4a, b, 6i. Tomographische Rekonstruktionen von kryo-FIB-gemahlenen N. caninum-Zellen und die entsprechenden Subtomogramm-Mittelwerte und Datenanalysen sind in den Abbildungen dargestellt. 1–6, 7a–f, h–k und ergänzende Abbildungen. 2g, h, 3, 4c–l, 5, 6a–h, 7, 8. Zur Herstellung von Parasiten für Kryo-ET wurden hochinfizierte HFF-Monoschichten durch Passage durch eine 27-Gauge-Nadel mechanisch aufgebrochen, um die Parasiten freizusetzen. Für „zurückgezogene Konoid“-Proben wurden Parasiten in „Endo-Puffer“ (44,7 mM K2SO4, 10 mM MgSO4, 106 mM Saccharose, 5 mM Glucose, 20 mM Tris-H2SO4, 3,5 mg/ml BSA, pH auf 8,2 mit H2SO4) gehalten. , wodurch die Parasiten in einem intrazellulären Zustand erhalten bleiben37. Für Proben mit „hervorstehenden Konoiden“ wurden die Parasiten nach der Freisetzung aus den Zellen in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung mit pH 7,4 gehalten. Alle Parasiten wurden durch einen 5-μm-Filter geleitet, um Zelltrümmer zu entfernen, in einem geeigneten Puffer gewaschen und durch 10-minütige Zentrifugation bei 300 × g gesammelt. Die Parasiten wurden im jeweiligen Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei 37 °C mit Vehikel (eingefahren) oder 10 μM Calciumionophor (hervorstehend; A23187; Cayman Chemicals) inkubiert. Etwa 4 μl der extrazellulären Parasiten wurden auf ein glühentladenes (30 s bei –30 mA) Kupfer-R2/2-Lochkohlenstoffgitter (Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Deutschland) pipettiert. Die Proben wurden 3–4 Sekunden lang mit einem Whatman-Filterpapier (Klasse 1) zurückgeblottet, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Anschließend wurde das Gitter mit einem selbstgebauten Tauchgefriergerät schnell in flüssiges Ethan eingefroren. Bei mit Detergenzien extrahierten Proben wurden die Membranen durch Zugabe von Triton-X-100 in HBSS für 3–4 Minuten extrahiert, bevor sie wie oben kurz in HBSS gewaschen und rückgeblottet wurden. Verglaste Gitter wurden in gekerbten Autogrids zum Kryo-FIB-Fräsen (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) montiert und bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert.

Autogrids mit vitrifizierten N. caninum-Zellen wurden in einen Kryo-Shuttle geladen und in ein Aquilos-Zweistrahlinstrument (FIB/SEM; Thermo Fisher Scientific) überführt, das mit einem auf minus 185 °C vorgekühlten Kryotisch ausgestattet war. Im SEM-Modus wurden Kachelbilder des Gitters erstellt und die für das Kryo-FIB-Fräsen geeigneten Zellen wurden mit der Maps-Software (Thermo Fisher Scientific) gezielt ausgewählt. Um die Probe zu schützen und die Leitfähigkeit zu verbessern, wurde die Probenoberfläche 20 s lang bei minus 30 mA Strom mit Platin sputterbeschichtet und dann mit einer Schicht aus metallorganischem Platin unter Verwendung des auf 27 °C vorgeheizten Gasinjektionssystems 5 s lang beschichtet ein Abstand von 1 mm vor dem Mahlen67, 68. Das Massenmahlen wurde mit einem 30-kV-Galliumionenstrahl von 50 pA senkrecht zum Gitter auf zwei Seiten einer Zielzelle durchgeführt. Anschließend wurde der Tisch zum Lamellenfräsen auf 10°–18° zwischen dem EM-Gitter und dem Galliumionenstrahl geneigt. Zum Grobfräsen wurde die Zelle mit 30-kV-Galliumionenstrahlen und einem Strom von 30 pA gefräst, gefolgt von 10 pA zum Polieren, bis die endgültige Lamelle 150–200 nm dick war. Der Mahlprozess wurde durch SEM-Bildgebung bei 3 keV und 25 pA überwacht. Insgesamt wurden 178 Lamellen von N. caninum in mehreren Sitzungen gemahlen.

Kryo-FIB-gemahlene Lamellen vitrifizierter apikaler Regionen der Parasiten wurden mit einem 300-keV-Titan-Krios-Transmissionselektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific) abgebildet, das mit einem Bioquantum-Postsäulen-Energiefilter (Gatan, Pleasanton, CA) ausgestattet war und im Zero-Loss-Verfahren eingesetzt wurde Modus mit einer Spaltbreite von 20 eV und einer Volta-Phasenplatte mit −0,5 μm Defokus69. Die Mikroskop-Steuerungssoftware SerialEM v4.0.8 wurde verwendet, um das Krios zu bedienen und Neigungsreihen von 56° bis –56° in 2°-Schritten unter Verwendung eines dosissymmetrischen Neigungsschemas im Verlustdosismodus zu sammeln70,71. Die Bilder wurden mit einer 5k × 6k K3-Direktelektronendetektionskamera (Gatan) bei einer Vergrößerung von 26.000x (3,15 Å Pixelgröße) aufgenommen. Es wurde der Zählmodus der K3-Kamera verwendet und für jedes Neigungsbild 15 Bilder (0,04 s Belichtungszeit pro Bild, die Dosisrate von ~28 e/Pixel/s; Bilder wurden im Super-Resolution-Modus aufgezeichnet und dann durch gruppiert). 2) wurden gefangen genommen. Die gesamte Elektronendosis pro Tilt-Serie war auf 100 e/Å2 begrenzt. Insgesamt wurden 167 Tilt-Serien von den kryo-FIB-gemahlenen Lamellen einheimischer Parasiten gesammelt, aber nur etwa 10 % von ihnen enthielten den vollständigen oder teilweisen apikalen Komplex. Es wurden 19 Neigungsserien des apikalen Bereichs von mit Detergens behandelten (nicht kryo-FIB-gemahlenen) Parasiten aufgezeichnet.

Es gibt mehrere Faktoren, die zur geringen Ausbeute des apikalen Komplexes in unseren Experimenten beitragen. Zunächst haben wir die intakten Parasiten in einer relativ dicken (>1 μm) Eisschicht tauchgefroren. Es ist eine Herausforderung, die apikalen und basalen Enden der in Eis eingebetteten Zellen im Kryo-FIB-Fräsinstrument zu bestimmen. Zweitens wurde während des Kryo-FIB-Frässchritts die Eisdicke von mehr als 1 μm auf 150–200 nm reduziert, wodurch mehr als 80 % des Volumens entfernt wurden. Daher ist die Wahrscheinlichkeit, die Lamelle genau im Bereich des etwa 300 nm breiten Konoids zu platzieren, relativ gering im Vergleich zum versehentlichen Wegfräsen des apikalen Komplexes während des Ausdünnungsschritts. Schließlich wurden etwa 10–15 % der Lamellen während des Übertragungsschritts vom Schleifinstrument zum TEM beschädigt oder oberflächlich kontaminiert. Zukünftige Anwendungen von fluoreszenzgesteuerten Kryo-FIB-Fräs- und Autoloader-Systemen für eine direktere Übertragung von FIB-gemahlenen Proben in das TEM könnten diese Probleme lösen und den Experimentdurchsatz erhöhen.

Die Bilder jedes Neigungsserienbilds wurden mit MotionCor2 v1.2.3 bewegungskorrigiert und dann mit dem aus dem IMOD v4.9.3-Softwarepaket72 extrahierten Skript zusammengeführt, um den endgültigen seriellen Neigungsdatensatz zu generieren. Bilder aus Neigungsserien wurden entweder ohne Bezugspunkte mithilfe von Patch-Tracking (Größe 800 × 800 Pixel) oder unter Verwendung dunkler Merkmale als Bezugspunkte (z. B. Körnchen aus der Sputterschicht oder eingebettetes Gallium aus dem Fräsprozess) mithilfe des IMOD-Softwarepakets ausgerichtet. Tomographische Rekonstruktionen wurden sowohl unter Verwendung einer gewichteten Rückprojektion vor der Mittelung des Subtomogramms als auch einer gleichzeitigen iterativen Rekonstruktionstechnik zur Visualisierung roher Tomogrammdaten mit höherem Kontrast, z. B. für die Partikelauswahl, berechnet. Von den aufgezeichneten 167 Neigungsserien mit kryo-FIB-gemahlenen nativen Parasiten wurden 125 Neigungsserien zur weiteren Untersuchung rekonstruiert, und 20 der rekonstruierten Tomogramme enthielten den apikalen Komplex (13 im hervorstehenden und sieben im zurückgezogenen Zustand). Subtomogramme, die die Konoidfaser, die ICMT- oder PCR-Wiederholungen enthalten, wurden aus den Rohtomogrammen extrahiert, ausgerichtet und mit der Kompensation fehlender Keile unter Verwendung des Programms PEET v1.10.073,74 gemittelt. Etwa 1160 bzw. 721 8-nm-Konoidfaser-Wiederholungen wurden aus den hervorstehenden bzw. zurückgezogenen nativen Konoid-Tomogrammen ausgewählt, und 386 8-nm-ICMT-Wiederholungen wurden aus den rekonstruierten Tomogrammen von Detergenz-extrahierten Proben ausgewählt. Für den PCR-Durchschnitt wurden 180 Subtomogramme aus vier Tomogrammen (drei hervorstehende und ein zurückgezogenes Konoid) ausgewählt und mit den SpikeInit-Funktionen in IMOD anfängliche Motivlisten mit Startorientierungen generiert. Fourier-Shell-Korrelationen wurden mit der calcFSC-Funktion berechnet und mit der plotFSC-Funktion in IMOD aufgezeichnet. Für die Mikronemspitze wurden 25 Subtomogramme aus drei Tomogrammen (zwei hervorstehend und eines zurückgezogen) extrahiert, ausgerichtet und gemittelt. Parameter zur Datenerfassung und -verarbeitung sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Zur Visualisierung roher tomografischer Schichten wurden Tomogramme zur Verbesserung der Klarheit entrauscht, indem entweder nichtlineare anisotrope Diffusion oder ein in IMOD implementierter gewichteter Medianfilter (Glattfilter) verwendet wurde. Isoflächen-Renderings und Zellsegmentierung mit manueller Färbung wurden mit dem Softwarepaket UCSF Chimera v1.10.275 erstellt, das von der Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics an der University of California, San Francisco, mit Unterstützung von NIH P41-GM103311 entwickelt wurde. Der Film wurde in Chimera gerendert und mit ffmpeg v5.1.1 komprimiert.

Rhoptrien, Mikroneme und Vesikel konnten anhand ihrer charakteristischen Morphologie unterschieden werden. Rhoptrien haben eine einzigartige Keulenform und könnten in zwei separate Strukturbereiche unterteilt werden – einen vorderen röhrenförmigen Hals und einen hinteren Bulbus, der tiefer im Zellkörper liegt. Mikroneme sind mittelgroße, stäbchenförmige Organellen und ihr Inneres wies eine dunklere Elektronendichte auf als andere Organellen. Die Vesikel, die eng mit dem ICMT oder der apikalen Plasmamembran verbunden sind, sind klein (Durchmesser <50 nm), rund oder oval und ihr Inhalt schien heller (dh geringere Elektronenstreuungseigenschaften) als das Zytoplasma.

Um die Konoidabmessungen zu messen, wurden Tomogramme in den IMOD-Slicer-Fenstern gedreht, wobei die untere Ebene horizontal ausgerichtet war. Der maximale Abstand im Längsschnitt über die Mitte des Konoids wurde dann zur Bestimmung der Abmessungen des Konoids verwendet, wie in der ergänzenden Abbildung 5a dargestellt. Drei hervorstehende und drei zurückgezogene Konoide wurden gemessen und verglichen. Die Längen der Konoidfasern wurden wie folgt gemessen: Nachdem die Konoidfasern manuell mit dem IMOD-Programm verfolgt wurden, wurden die Länge der Konoidfasern und der Abstand zwischen benachbarten Konoidfasern mit den IMOD-Befehlen imodinfo bzw. mtk bestimmt. Insgesamt wurden 20 Konoidfasern voller Länge aus den hervorstehenden Konoiden und 12 aus den zurückgezogenen Konoiden gemessen. Um die APRs und PCRs bei Parasiten mit hervorstehendem oder zurückgezogenem Konoid zu vergleichen, haben wir deren Durchmesser wie folgt gemessen: Die Tomogramme wurden im IMOD-Slicer-Fenster gedreht, bis Querschnittsansichten der PCRs und APRs gespeichert werden konnten (wie in der ergänzenden Abbildung zu sehen). 5b, c); Anschließend wurden die Durchmesser der Ringe mit den Kreiswerkzeugen von ImageJ (Fidschi-Verteilung v1.53c) bestimmt. Es wurden drei APRs und drei PCRs von hervorstehenden Konoiden sowie drei APRs und zwei PCRs von zurückgezogenen Konoiden gemessen. Der Abstand zwischen dem Konoid und dem IMC wurde wie folgt gemessen: Wir positionierten den Mittelpunkt der Ansicht im IMOD-Slicer-Fenster am apikalen Ende des IMC und drehten dann das Tomogramm um diesen Mittelpunkt in 3D, um den kürzesten Abstand zwischen dem zu finden Konoid und das apikale Ende des IMC.

Wir haben die Anzahl repräsentativer Tomogramme für jedes Figurenfeld in der Ergänzungstabelle S2 zusammengefasst.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Subtomogramm-Durchschnittsdichtekarten der Neospora caninum-Konoidfaser im hervorstehenden und zurückgezogenen Zustand sowie ein globaler Durchschnittswert aus beiden Zuständen wurden in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) mit den Zugangscodes EMD-28247, EMD-28249 hinterlegt. bzw. EMD-26873. Die Subtomogramm-Durchschnittsdichtekarten der PCRs P1-P2, P3 und die zusammengesetzte Karte von P1-P2-P3 wurden in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) mit den Zugangscodes EMD-28231, EMD-28234 und EMD- hinterlegt. 28246 bzw. Alle anderen Daten, die zur Bewertung der Schlussfolgerungen in der Arbeit erforderlich sind, sind in der Arbeit und/oder den ergänzenden Materialien enthalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Daniel Stoddard für die Schulung und Leitung der Kryo-Elektronenmikroskopie-Einrichtung am Southwestern Medical Center der University of Texas, die teilweise durch den CPRIT Core Facility Support Award RP170644 unterstützt wird. Diese Forschung wurde teilweise durch die Rechenressourcen der BioHPC-Supercomputing-Einrichtung im Lyda Hill Department of Bioinformatics des UT Southwestern Medical Center unterstützt.

Kai Cai

Derzeitige Adresse: Department of Biophysics, University of Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA

Abteilung für Zellbiologie, University of Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA

Long Gui, Kai Cai, Evan Reetz & Daniela Nicastro

Abteilung für Pharmakologie, University of Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA

William J. O'Shaughnessy und Michael L. Reese

Abteilung für Biochemie, University of Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA

Michael L. Reese

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MLR und DN konzipierten das Projekt; LG führte eine Tomogramm-Rekonstruktion, Subtomogramm-Mittelung, Datenanalyse, Abbildungs- und Filmvorbereitung durch; WJO führte Zellkultur, Probenvorbereitung und Datenanalyse durch; KC führte Kryovorbereitung, Kryo-ET-Datenerfassung und erste Bildverarbeitung durch; ER führte Kryo-FIB-Fräsen durch; MLR führte eine Datenanalyse durch und verfasste das Manuskript mit Hilfe von LG und DN; DN führte eine Datenanalyse durch und überwachte das Gesamtprojekt. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH; R01GM083122 bis DN und R01AI150715 bis MLR), dem Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT; RR140082 bis DN), der National Science Foundation (MCB1553334 bis MLR) und dem unterstützt Welch Foundation (I-2075-20210327 an MLR).

Korrespondenz mit Michael L. Reese oder Daniela Nicastro.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Naomi Morrissette und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Gui, L., O'Shaughnessy, WJ, Cai, K. et al. Die Kryotomographie zeigt die Bewegung des starren Körpers und die Organisation der Apikomplexan-Invasionsmaschinerie. Nat Commun 14, 1775 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37327-w

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Eingegangen: 30. September 2022

Angenommen: 10. März 2023

Veröffentlicht: 30. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37327-w

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