Schwere Entzündung im neuen

BMC Medicine Band 20, Artikelnummer: 235 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Eine neonatale Sepsis kann im Jugend- oder Erwachsenenalter zu einer langfristigen kognitiven Beeinträchtigung führen, der zugrunde liegende molekulare Mechanismus ist jedoch nicht vollständig geklärt. Die Expression des K+-Cl–-Cotransporters 2 (KCC2) spielt eine entscheidende Rolle bei der GABAergen Verschiebung von der Depolarisierung zur Hyperpolarisierung während der frühen postnatalen Entwicklung. In dieser Studie wollten wir feststellen, ob eine schwere entzündungsbedingte kognitive Beeinträchtigung des Neugeborenen mit der Expression von KCC2 während der frühen Entwicklung zusammenhängt.

Eine schwere neonatale Entzündung wurde durch intraperitoneale Injektion von hochdosiertem Lipopolysaccharid (LPS, 1 mg kg–1) bei Ratten am 3. postnatalen Tag (P3) festgestellt. Zur Untersuchung langfristiger kognitiver Funktionen wurden die Morris-Wasserlabyrinth-Aufgabe und der Angstkonditionierungstest eingesetzt. ELISA, RT-PCR und Western Blot wurden verwendet, um die Expressionsniveaus von proinflammatorischen Zytokinen und KCC2 zu untersuchen. Zur Bestimmung der GABAergen Verschiebung wurden perforierte Patch-Clamping-Aufnahmen verwendet.

Schwere Entzündungen bei Neugeborenen führten bei Ratten zu einer langfristigen kognitiven Beeinträchtigung. Unterdessen wurde im Hippocampus bis P30 nach der LPS-Injektion ein anhaltender Anstieg der Interleukin-1-beta (IL-1β)-Spiegel festgestellt. Eine erhöhte Expression von KCC2 und hyperpolarisiertem GABA-Umkehrpotential (EGABA) wurde in CA1-Hippocampus-Pyramidenneuronen der P7-P10- und P14-P16-Ratten nach LPS-Injektion beobachtet. Ein spezifischer Abbau der IL-1β-mRNA-Expression rettete die erhöhte Expression von KCC2 und dem hyperpolarisierten EGABA bei P7-P10 und P14-P16. Dementsprechend verbesserte die spezifische Unterdrückung der IL-1β- oder KCC2-Expression die kognitive Beeinträchtigung, die durch schwere neonatale Entzündungen verursacht wurde.

Eine anhaltende Erhöhung von IL-1β im Hippocampus kann durch eine Hochregulierung von KCC2 während der frühen Entwicklung zu einer kognitiven Beeinträchtigung führen.

Peer-Review-Berichte

Sepsis ist ein lebensbedrohliches Syndrom, das aus einer fehlregulierten Reaktion des Wirts auf Infektionen resultiert [1], insbesondere bei Neugeborenen. Eine neonatale Sepsis wird normalerweise durch das Eindringen von Bakterien in den Blutkreislauf innerhalb des ersten Lebensmonats verursacht [2] und ist eine der Haupttodesursachen auf Neugeborenen-Intensivstationen [3, 4]. Die Weltgesundheitsorganisation schätzt, dass die Neugeborenensepsis weltweit eine Million Todesfälle pro Jahr verursacht, und 42 % dieser Todesfälle ereignen sich in der ersten Woche nach der Geburt [5]. In den letzten Jahren hat sich die Überlebensrate bei Neugeborenensepsis durch den medizinischen Fortschritt deutlich verbessert. Leider besteht bei Überlebenden einer neonatalen Sepsis ein erhöhtes Risiko für langfristige kognitive Beeinträchtigungen [6,7,8]. Der molekulare Mechanismus, durch den eine Sepsis bei Neugeborenen eine langfristige kognitive Beeinträchtigung hervorruft, bleibt jedoch unklar.

Während einer Sepsis sind die Expressionsniveaus proinflammatorischer Zytokine wie TNF, IL-6 und IL-1β im Zentralnervensystem (ZNS) erhöht, was vermutlich eine entscheidende Rolle bei der langfristigen kognitiven Beeinträchtigung nach einer Sepsis spielt [ 9, 10]. Die systemische Injektion von Lipopolysaccharid (LPS), einem bakteriellen Endotoxin, wird häufig verwendet, um bei neugeborenen Tieren eine Entzündung auszulösen, um die zahlreichen Komplikationen wie kognitive Beeinträchtigungen zu reproduzieren, die auch bei menschlichen Neugeborenen nach einer Sepsis beobachtet werden [11,12,13, 14]. Die Injektion von LPS kann einen Anstieg der proinflammatorischen Zytokine, einschließlich TNF, IL-6 und IL-1β, induzieren [15]. Insbesondere spielt IL-1β eine zentrale Rolle bei der anhaltenden Neuroinflammation nach einer Sepsis und ist eng mit der Gedächtnisverarbeitung und der langfristigen Potenzierung sowie der durch Sepsis bei Neugeborenen verursachten kognitiven Beeinträchtigung verbunden [10, 16, 17]. Allerdings bleibt unklar, wie IL-1β die durch Sepsis bei Neugeborenen verursachte kognitive Beeinträchtigung, insbesondere während der Entwicklungsphase des ZNS, vermittelt.

γ-Aminobuttersäure (GABA) ist der wichtigste hemmende Neurotransmitter im ZNS. Interessanterweise vermittelt GABA die depolarisierenden Wirkungen im frühen Entwicklungsstadium verschiedener Teile des ZNS von Wirbeltieren aufgrund einer hohen intrazellulären Chloridkonzentration, die durch einen Importer, den Na+-K+-2Cl–-Cotransporter 1 (NKCC1), aufrechterhalten wird [18]. Die depolarisierenden Wirkungen von GABA spielen eine wichtige Rolle bei der Zellproliferation und dem Überleben, der Migration, der Differenzierung und der frühen Netzwerkverkabelung [18]. In den letzten Jahren haben neue Erkenntnisse Erkenntnisse über die Rolle der depolarisierenden GABA-Signalübertragung in vivo gewonnen [18, 19], die möglicherweise regional abhängig ist. Beispielsweise vermitteln depolarisierende Effekte der GABAergen Übertragung eine erregende Modulation im Hippocampus von Mäusen [19], wohingegen sie im Neocortex von Mäusen während der frühen postnatalen Entwicklung hemmende Effekte verursachen [18, 19, 20]. Während der postnatalen Entwicklung wurde eine Verschiebung von depolarisierenden zu hyperpolarisierenden Wirkungen der GABAergen Aktivierung durch eine verstärkte Chloridextrusion induziert, die durch eine Hochregulierung des K+-Cl–-Cotransporters 2 (KCC2) vermittelt wurde [21,22,23,24]. Diese entwicklungsbedingte GABAerge Verschiebung kann als Indikator für das Reifungsstadium bestimmter neuronaler Populationen dienen [25] und ist mit der synaptischen Entwicklung und neuronalen Plastizität verbunden [26]. KCC2 legt nicht nur die Polarität der GABAergen Funktion während der neuronalen Reifung fest, sondern hat auch tiefgreifende, vom Ionentransport unabhängige Funktionen, wie die Modulation der Entwicklungsapoptose und früher Netzwerkaktivitäten, und ist an mehreren Krankheiten beteiligt [18, 27, 28, 29].

Obwohl frühere Studien zeigten, dass IL-1β die Expression von KCC2 im ZNS regulieren kann [27, 30], ist nicht bekannt, ob eine abnormale GABAerge Verschiebung, die durch eine veränderte Expression von KCC2 hervorgerufen wird, langfristig an einer Sepsis bei Neugeborenen oder einer schweren Entzündung beteiligt ist kognitive Beeinträchtigung. Hierin stellten wir die Hypothese auf, dass eine anhaltende Erhöhung der IL-1β-Spiegel die GABAerge Verschiebung beeinflusste, indem sie die KCC2-Expression in CA1-Hippocampus-Pyramidenneuronen während der Entwicklungsphase modulierte, was schließlich zu einer langfristigen kognitiven Beeinträchtigung nach einer schweren Entzündung des Neugeborenen beitrug.

Das Versuchsprotokoll wurde von der Tierethikkommission des West China Hospital der Sichuan-Universität (Chengdu, Sichuan, China) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien „Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments“ (ARRIVE) durchgeführt. Sprague-Dawley-Ratten am 16. Gestationstag wurden gekauft (Chengdu Dossy Experimental Animals CO., LTD.) und getrennt und auf den Geburtstag des Nachwuchses überwacht. Postnatale Nachkommen (beide Geschlechter) wurden bei ihren Müttern gehalten, wobei Futter und Wasser nach Belieben zur Verfügung standen. Die Tiere wurden in einem 12-stündigen (7:00 bis 19:00) Hell-Dunkel-Zyklus bei konstanter Luftfeuchtigkeit (45–55 %) und Temperatur (22–24 °C) gehalten. Nach dem Absetzen bei P21 wurden die Tiere in Gruppen von fünf Ratten pro Käfig gehalten.

LPS (Sigma, USA) wurde in normaler Kochsalzlösung gelöst und bei P3 mit einer Dosis von 1 mg kg−1 intraperitoneal injiziert. IL-1β-siRNA (Sense-Sequenz: 5'-GCACAGACCUGUCUUCCUATT-3'; Antisense-Sequenz: 5'-UAGGAAGACAGGUCUGUGCTT-3'), mit der Modifikation von 5'-FAM, KCC2-siRNA (Sense-Sequenz: 5'-GCCAUUUCCAUGAGCGCAATT- 3'; Antisense-Sequenz: 5'-UUGCGCUCAUGGAAAUGGCTT-3') mit der Modifikation von 5'-CY5 und Negativkontrolle (Kontroll-siRNA, Sense-Sequenz: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'; Antisense-Sequenz: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT- 3') (GenePharma, Shanghai, China) wurden in RNase-freiem Wasser gelöst. IL-1β-siRNA, KCC2-siRNA oder Negativkontrolle wurden 20 Minuten vor der Injektion mit In-vivo-SilenceMag™-Transfektionsreagenz (OZ Biosciences, Marseille, Frankreich) auf eine Endkonzentration von 1 μg μL-1 gemischt. Anschließend wurde IL-1β-siRNA, KCC2-siRNA oder eine Negativkontrolle in die bilateralen CA1-Regionen des Hippocampus (0,5 μl für jede Seite) bei P2 und/oder P7 injiziert.

Ratten wurden auf Eis gelegt, um eine Unterkühlungsanästhesie auszulösen, wie in einer früheren Studie beschrieben (31), und in einem stereotaktischen Gerät (RWD, Shenzhen, China) montiert. Augensalbe wurde auf die Augen von P7-Ratten aufgetragen. IL-1β-siRNA/KCC2-siRNA/Kontroll-siRNA (0,5 μl) wurde bilateral in die CA1-Regionen des Hippocampus injiziert (Mittelpunkt zwischen Bregma und sagittaler Naht, lateral: ± 1,5 mm, Tiefe: 1,2–1,4 mm für P2 und 1,6). –1,8 mm für P7) bei einer Rate von 100 nL min−1. Nach Abschluss der Injektion wurde die Glaspipette 5 Minuten lang an Ort und Stelle belassen und langsam herausgezogen, um einen Rückfluss zu vermeiden. Anschließend durften sich die Tiere auf einer Heizdecke erholen, bevor sie in ihre Heimkäfige zurückkehrten.

Um Wurfeffekte zu minimieren, wurden postnatale Nachkommen beiderlei Geschlechts aus jedem Wurf zufällig in die Versuchsgruppen eingeteilt. Anschließend wurden die Welpen zu ihren Muttertieren zurückgebracht und bis P21 entwöhnt. Nach P21 wurden die Ratten in jeder Versuchsgruppe zusammengefasst und nach dem Zufallsprinzip 5 Ratten pro Käfig (gleichen Geschlechts) untergebracht. Daher stammten die Ratten in jedem Käfig aus unterschiedlich zufälligen Würfen. Alle Tierzuordnungen wurden durchgeführt, um eine annähernd gleiche Verteilung von Geschlecht und Behandlung in jedem Wurf sicherzustellen. Für die verschiedenen Versuchskohorten wurden keine unterschiedlichen Würfe verwendet. Das neonatale schwere Entzündungsmodell wurde durch intraperitoneale Injektion einer hohen Dosis LPS (1 mg kg−1) bei P3-Ratten induziert. In der Kontrollgruppe erhielten die Ratten nur eine intraperitoneale Injektion normaler Kochsalzlösung (NS). In der LPS-Gruppe erhielten die Ratten eine intraperitoneale Injektion von LPS allein. In der NS + Kontroll-siRNA-Gruppe erhielten Ratten eine Hippocampus-CA1-Injektion von Kontroll-siRNA und eine intraperitoneale Injektion von normaler Kochsalzlösung. In der LPS + Kontroll-siRNA-Gruppe erhielten Ratten eine Hippocampus-CA1-Injektion von Kontroll-siRNA und eine intraperitoneale Injektion von LPS. In der LPS + IL-1β-siRNA-Gruppe erhielten Ratten eine Hippocampus-CA1-Injektion von IL-1β-siRNA und eine intraperitoneale Injektion von LPS. In der LPS + KCC2-siRNA-Gruppe erhielten Ratten eine Hippocampus-CA1-Injektion von KCC2-siRNA und eine intraperitoneale Injektion von LPS.

Das räumliche Lernen und das Gedächtnis heranwachsender Ratten wurden wie zuvor beschrieben mit dem Morris-Wasserlabyrinth-Test bewertet (32). Kurz gesagt bestand das System aus einem runden Becken (90 cm Durchmesser, 50 cm Tiefe), das in vier Quadranten unterteilt war. An der Wand jedes Quadranten wurden unterschiedlich geformte Objekte angebracht, die als räumliche visuelle Hinweise dienten. Die Wassertemperatur wurde bei 30 ± 1 °C gehalten. Eine kreisförmige Plattform mit einem Durchmesser von 10 cm wurde 1 cm unter der Schwarzwasseroberfläche und 30 cm von der Beckenwand entfernt platziert. Der Quadrant, der die Plattform enthält, wurde als Zielquadrant definiert. Die Schwimmspuren der Ratten wurden mit einer automatischen Videokamera aufgezeichnet. Vor dem Orientierungsnavigationstest wurde jede Ratte an vier aufeinanderfolgenden Tagen dreimal täglich trainiert. Die Ratte wurde mit dem Gesicht zur Beckenwand ins Wasser gelegt. Wenn die Ratte die Plattform innerhalb von 90 s fand und 15 s auf der Plattform blieb, wurde der Zeitraum als Fluchtlatenz definiert. Ansonsten wurde die Ratte zur Plattform geführt, wo sie 15 Sekunden blieb, und die Fluchtlatenz wurde mit 90 Sekunden aufgezeichnet. Während des Tests wurde die Plattform entfernt und die Ratte konnte 90 Sekunden lang schwimmen. Erfasst wurden die Anzahl der Überfahrten im Zielgebiet, die im Zielquadranten verbrachte Zeit und die insgesamt zurückgelegte Distanz sowie die mittlere Geschwindigkeit. Mithilfe der SMART-Software (Panlab, Barcelona, Spanien) wurde die Schwimmspur jeder Ratte analysiert.

Zwei Tage nach dem Morris-Wasserlabyrinth wurden dieselben Ratten dem Angstkonditionierungstest gemäß dem zuvor beschriebenen Paradigma mit geringfügigen Modifikationen unterzogen (33). Ratten wurden darauf trainiert, den Kontext (Kammer) mit einem aversiven Reiz (Fußschock; unbedingter Reiz, US) zu verbinden, der zur Beurteilung der Hippocampus-abhängigen kontextuellen Angstkonditionierung verwendet werden kann. Der Fußschock wurde auch mit einem Tonreiz (konditionierter Reiz, CS) gepaart, um die Hippocampus-unabhängige Reizfurchtkonditionierung zu beurteilen. Konditionierte Angst zeigte sich als erstarrendes Verhalten, indem alle Bewegungen außer der Atmung eingestellt wurden, wenn die Ratten erneut dem Kontext oder dem Ton ausgesetzt wurden. Die Trainingsparameter waren wie folgt: Ton, 30 s, 80 dB, 2 kHz; Schock, 2 s, 0,8 mA. Am ersten Tag wurde jede Ratte in eine Angstkonditionierungskammer gebracht und durfte sich 2 Minuten lang frei erkunden. Dann wurde ein Ton abgegeben, gefolgt von einem Fußschock. Zwei Minuten später wurde ein zweites CS-US-Paar geliefert. Am zweiten Tag wurde jede Ratte erneut derselben Angstkonditionierungskammer ausgesetzt, jedoch ohne Abgabe eines CS oder Fußschocks. Das Einfrieren wurde 3 Minuten lang aufgezeichnet. Eine Stunde später wurde jede Ratte in einen neuen Kontext gestellt, der einen anderen Geruch, eine andere Reinigungslösung, eine andere Bodenbeschaffenheit und eine andere Kammerwand enthielt. Den Ratten wurde erlaubt, die Umgebung 2 Minuten lang zu erkunden, bevor sie erneut dem Ton ausgesetzt wurden. Das Einfrieren wurde 3 Minuten lang beurteilt und dann mit dem ANY-maze-Videoverfolgungssystem und der Software (Stoelting, Wood Dale, IL) gemessen.

Die Ratten wurden mit Pentobarbital-Natrium (100 mg kg−1) anästhesiert und transkardial mit eiskalter Ringer-Lösung perfundiert. Der Hippocampus wurde schnell entfernt und mit eiskaltem Lysepuffer (Beyotime, China), der Phosphatase- und Proteaseinhibitoren enthielt, homogenisiert. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA Protein Assay Kit (Beyotime, China) bestimmt. Zwanzig Mikrogramm Proteinproben wurden mit einem NuPAGETM4-12 % Bis-Tris-Gel (Thermo Fisher Scientific) aufgetrennt und unter Verwendung des iBLOT2-Systems auf Polyvinylidendifluorid-Membranen (Thermo Fisher Scientific) übertragen. Die Membran wurde 2 Stunden lang in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 und 5 % fettfreier Milch blockiert und dann über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert, einschließlich Kaninchen-Anti-IL-1β (1:2000, Abcam ), Kaninchen-Anti-KCC2 (1:1000, Sigma-Aldrich) und Kaninchen-Anti-β-Actin (1:1000, Proteintech). Anschließend wurden die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Kaninchen (1:5000, Proteintech, China) inkubiert und mit Chemilumineszenzreagenzien (ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) unter Verwendung des Chemidoc XRS-Systems gescannt (Bio-Rad). Die Dichte der Banden wurde mit der ImageJ-Software analysiert. Die Dichte der Banden der Kontrollgruppe wurde auf 100 % festgelegt. Die relativen Dichtewerte der anderen Gruppen wurden bestimmt, indem die Dichtewerte dieser Gruppen durch die Kontrollwerte dividiert wurden, nachdem jede Gruppe auf β-Actin normiert wurde. Originalbilder für Western-Blot-Ergebnisse wurden in der Zusatzdatei 1 gezeigt.

Die Gesamt-RNA des Hippocampus wurde mit einem Eastep® Super RNA-Extraktionskit (Promega, Shanghai, China) isoliert, gefolgt von einer reversen Transkription mit einem GoScript™ Reverse Transcription Kit (Promega, Shanghai, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Abschließend wurde die RT-PCR mit GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, Shanghai, China) und spezifischen Primern (Sangon Biotech, Shanghai, China) durchgeführt. Die relative Änderung der Genexpression wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode mit GAPDH als interner Kontrolle berechnet [34]. Die zum Nachweis von TNF-, IL-6-, IL-1β-, KCC2- und GAPDH-mRNA verwendeten Primer waren wie folgt:

TNF vorwärts: 5'-CTGTGAAGGGAATGGGTGTT-3';

TNF-Reverse: 5'-CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC-3';

IL-6 vorwärts: 5'-GGCCCTTGCTTTCTCTTCG-3';

IL-6-Rückseite: 5'-ATAATAAAGTTTTGATTATGT-3';

IL-1β vorwärts: 5'-AGTTGACGGACCCAAAAG-3';

IL-1β rückwärts: 5'-AGCTGGATGCTCTCATCAGG-3';

KCC2 vorwärts: 5'- AGGTGGAAGTCGTGGAGATG-3';

KCC2-Rückseite: 5'-CGAGTGTTGGCTGGATTCTT-3';

GAPDH vorwärts: 5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3';

GAPDH-Rückseite: 5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'.

ELISA-Experimente wurden durchgeführt, um die Konzentrationen proinflammatorischer Zytokine, einschließlich TNF, IL-1β und IL-6, im Blutserum zu quantifizieren. Kurz gesagt, Ratten wurden mit ~ 3 % Sevofluran betäubt. Blutproben (200–500 μl) wurden direkt aus dem Herzen entnommen, in EDTA-Röhrchen aufbewahrt und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2000 g zentrifugiert, um das Serum von den zellulären Blutbestandteilen zu trennen. Die Überstände wurden sofort extrahiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur Bestimmung der Zytokinspiegel wurden ELISA-Kits (Neobioscience) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Tecan Sunrise™-Mikroplattenlesegerät mit Wellenlängenkorrektur bei 680 nm gemessen, das mit der Magellan-Software verbunden war. Die Proteinkonzentration der Proben wurde anhand der gemessenen optischen Dichte der Reaktion entsprechend der optischen Dichte der bekannten Standardproben bestimmt.

Ratten beiderlei Geschlechts im Alter von P7–P10, P14–P16 oder P28–P32 wurden mit Pentobarbitalnatrium (100 mg kg–1) anästhesiert. Das Gehirn wurde schnell präpariert und transversale dorsale Hippocampusschnitte (300 μm dick) wurden in eiskalter, auf Saccharose basierender, künstlicher Liquor cerebrospinalis erhalten, die (in mM) enthielt: 260 Saccharose, 26 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 CaCl2, 5 MgCl2 und 10 Glucose mit einem Vibratom (VT1000 A; Leica). Die Schnitte wurden sofort übertragen und bei 35 °C mit künstlicher Liquor cerebrospinalis, enthaltend (in mM): 130 NaCl, 3 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3 und 10 Glucose, 45 Minuten lang inkubiert und dann bei Raumtemperatur aufbewahrt Temperatur (24–26 °C) vor der Aufnahme 30 Minuten lang. Durch die Schnitt- und Inkubationslösung wurden kontinuierlich 95 % O2/5 % CO2 mit einem pH-Wert von 7,35 geleitet.

Hippocampusschnitte wurden in einer Aufzeichnungskammer montiert und mit künstlicher Liquor cerebrospinalis (aCSF) mit einer Flussrate von 2–3 ml/min perfundiert und mit 95 % O2 und 5 % CO2, pH = 7,35, durchströmt. CA1-Pyramidenzellen wurden nacheinander untersucht, beginnend in der Nähe der CA2/CA1-Grenze und weiter nach medial an gut getrennten Stellen. Pyramidenneuronen wurden dann unter Differentialkontrast-/Infrarotbeleuchtung anhand ihrer Lage in der Zellkörperschicht und ihrer Pyramidenform identifiziert. Perforierte Aufzeichnungen wurden mit Patchpipetten (6–8 MΩ) durchgeführt, die mit der internen Lösung gefüllt waren, die (in mM) 140 K-Gluconat, 10 HEPES, 5 EGTA, 1 MgCl2, 2 Na2-ATP, 0,3 Na2-GTP und einen auf 7,2 eingestellten pH-Wert enthielt mit KOH und Osmolarität bis ~ 285 mOsm. Patchpipetten wurden vorne minimal mit der internen Standardlösung gefüllt und dann mit Gramicidin-haltiger Lösung wieder aufgefüllt. Gramicidin (HY-P0163, MedChemExpress), gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Endkonzentration von 50 μg mL−1, wurde als Porenbildner für perforierte Aufnahmen verwendet. Gramicidin-Kanäle sind selektiv durchlässig für einwertige Kationen und kleine neutrale Moleküle, aber undurchlässig für Chlorid, was den elektrischen Zugang zu aufgezeichneten Neuronen ermöglicht, ohne deren anionische Gradienten zu stören. Innerhalb von ca. 20–40 Minuten nach der Giga-Seal-Bildung sank der Zugangswiderstand langsam und stabilisierte sich bei ca. 20–35 MΩ. Anschließend wurde das Ruhemembranpotential (RMP) als Spannung ohne eingespeisten Strom aufgezeichnet. Zur Abschätzung der Chloridkonzentration wurde das GABA-Umkehrpotential (EGABA) ausgewertet. Die Neuronen wurden auf –60 mV gehalten und das Membranpotential wurde auf verschiedene Testpotentiale von –80 bis –30 mV erhöht. Während jedes Membranpotentialschritts wurde GABA (10 μM) in extrazellulärer Lösung durch Badanwendung zugeführt, um Ströme in Gegenwart von Cyanquixalin (CNQX, 10 μM) und DL-2-Amino-5-phosphonopentansäure (40 μM) zu aktivieren. Eine lineare Regression zwischen der Amplitude der GABA-induzierten Ströme und dem Membranpotential wurde berechnet, und der Schnittpunkt dieser Linie mit der Abszisse wurde als EGABA genommen. Alle elektrophysiologischen Aufzeichnungen wurden mit einem Axopatch 700B-Verstärker und einem Digidata1440-Digitalisierer durchgeführt, der an einen Computer mit der Software pClamp 10.2 (Molecular Devices, Sunnyvale, USA) angeschlossen war. Die Signale wurden mit 20 kHz abgetastet und mit 10 kHz gefiltert. Zell- und Elektrodenkapazitäten wurden während der Aufzeichnung elektronisch kompensiert. Die Zelle wurde verworfen, wenn sich der Zugangswiderstand um > 25 % änderte.

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt und statistische Analysen wurden mit der GraphPad Prism 8.0-Software (GraphPad Software, CA, USA) durchgeführt. Die Normalität der Datenverteilung wurde mithilfe des Shapiro-Wilk-Tests bewertet. Für den Vergleich parametrischer Verteilungsdaten bzw. nichtparametrischer Verteilungsdaten zwischen zwei Gruppen wurden gepaarte/ungepaarte Student-t-Tests oder Mann-Whitney-U-Tests verwendet. Daten von drei oder mehr Gruppen wurden mithilfe einer ein- oder zweifachen Varianzanalyse (ANOVA) mit wiederholten Messungen, gefolgt von einem Bonferroni- oder Tukey-Post-hoc-Test, analysiert. Die genaue Analyse, die für jeden Vergleich verwendet wurde, wurde in den Legenden der Abbildungen beschrieben und alle statistischen Informationen für jedes Ergebnis wurden in der Zusatzdatei 2: Tabelle S1-S11 zusammengefasst. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Bei P3-Ratten wurde ein neonatales Entzündungsmodell induziert (Abb. 1A). Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die Körpergewichtszunahme der Ratten während der Entwicklung in der LPS-Gruppe langsamer (Abb. 1B, n=8, ** P < 0,01, *** P < 0,001 vs. Kontrollgruppe). Bei den Ratten der Kontrollgruppe wurde kein Tod festgestellt, während in der LPS-Gruppe eine Mortalität von 36,7 % beobachtet wurde (Abb. 1C, ** P < 0,01). Das Training in der Morris-Wasserlabyrinth-Aufgabe (MWM) wurde von P28 bis P31 durchgeführt. Während der vier Tage des Erwerbstrainings nahm die Fluchtlatenz sowohl bei den Ratten der Kontroll- als auch der LPS-Gruppe allmählich ab, was darauf hindeutet, dass beide Gruppen Hippocampus-abhängiges räumliches Lernen und Gedächtnisbildung zeigten (Abb. 1D). Allerdings war die Fluchtlatenz bei Ratten der LPS-Gruppe im Vergleich zu Kontrollratten am Trainingstag 4 signifikant erhöht, was auf eine mögliche Beeinträchtigung der Gedächtnisbildung hinweist (Abb. 1D, n = 15–19, P = 0,029). Während des räumlichen Sondentests (Abb. 1E) wurden die aufgewendete Zeit (Abb. 1F, n= 15–19, *** P < 0,001) und die Distanz (Abb. 1G, n= 15–19, *** P) ermittelt < 0,001) im Zielquadranten sowie die Zeiten, in denen die Plattform überquert wurde (Abb. 1H, n = 15–19, *** P < 0,001), waren in der LPS-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe kürzer. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der mittleren Geschwindigkeit der Ratten zwischen den beiden Gruppen festgestellt (Abb. 1I, n = 15–19, P = 0,065), was darauf hindeutet, dass die Bewegungsfähigkeit durch die LPS-Injektion nicht beeinträchtigt wurde. Dieselben Ratten wurden dann einem Angstkonditionierungstest (FC) unterzogen (Abb. 1J). Nach dem Training bei P34 (Abb. 1K) zeigten Ratten in der LPS-Gruppe im Vergleich zu Ratten in der Kontrollgruppe ein verringertes Einfrieren in Hippocampus-abhängigen Kontexttests (Abb. 1L, n = 15–19, *** P < 0,001). Beim Hippocampus-unabhängigen Cue-Ton-Test bei P35 wurde jedoch kein Unterschied beobachtet (Abb. 1M, n = 15–19, P = 0,474).

Eine schwere neonatale Entzündung führt bei heranwachsenden Ratten zu einer langanhaltenden kognitiven Beeinträchtigung. (A) Schematische Darstellung der chronologischen Reihenfolge, die für die Erstellung des Entzündungsmodells und der kognitiven Tests verwendet wurde. In dieser Versuchskohorte wurden fünf Würfe verwendet. (B) Die Entwicklung des Körpergewichts bei Ratten (n = 8). (C) Die Überlebenskurve von Ratten. (D) Lernkurve für die Escape-Latenz. (E) Repräsentative Spuren für den MWM-Test. (F) Die im Zielquadranten verbrachte Zeit (n = 15–19). (G) Im Zielquadranten zurückgelegte Distanz (n = 15–19). (H) Anzahl der Bahnsteigübergänge (n = 15–19). (I) Mittlere Geschwindigkeit während des räumlichen Sondentests (n = 15–19). (J) Das experimentelle Protokoll für FC. (K) Die Gefrierzeit von Ratten während des FC-Trainings. (L) Die Gefrierzeit von Ratten im Kontext-FC-Test (n = 15–19). (M) Die Gefrierzeit von Ratten im Cued-FC-Test (n = 15–19). LPS: Lipopolysaccharid; NS: normale Kochsalzlösung; MWM: Morris-Wasserlabyrinth; FC: Angstkonditionierung; Die Panels B, D und K wurden durch eine Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen verglichen, gefolgt von einem Bonferroni-Post-hoc-Test; Panel C wurde mittels Log-Rank-Test verglichen; Die Panels F, G, H, I, L und M wurden durch einen ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test verglichen; * P < 0,05, ** P < 0,01 und *** P < 0,001, ns: keine Signifikanz; Fehlerbalken zeigen SD an

Bemerkenswert ist, dass während des Peer-Reviews zusätzliche Analysen durchgeführt wurden, um festzustellen, ob die durch schwere Entzündungen verursachte kognitive Beeinträchtigung des Neugeborenen geschlechtsabhängig war. Im MWM-Test wurde kein signifikanter Geschlechtsunterschied festgestellt, da sowohl männliche als auch weibliche septische Ratten eine ähnliche Verringerung der aufgewendeten Zeit aufwiesen (Zusatzdatei 3: Abb. S1A links, n = 9, ** P < 0,01 für Männer; Zusatzdatei 3: Abb . S1A rechts, n = 6–10, ** P < 0,01 für Frauen) und der Abstand (Zusatzdatei 3: Abb. S1B links, n = 9, ** P < 0,01 für Männer; Zusatzdatei 3: Abb. S1B rechts, n = 6–10, P = 0,046 für weiblich) im Zielquadranten, sowie die Zeiten, die den Bahnsteig überqueren (Zusatzdatei 3: Abb. S1C links, n = 9, *** P < 0,001 für männlich; Zusatzdatei 3: Abb. S1C rechts, n = 6–10, *** P < 0,001 für weiblich) im Vergleich zu den Kontrollratten. In ähnlicher Weise kam es im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einem verringerten Einfrieren bei kontextbezogenen Tests (Zusatzdatei 3: Abb. S1D links, n = 9, *** P < 0,001 für Männer; Zusatzdatei 3: Abb. S1D rechts, n = 6–10 , *** P < 0,001 für Frauen) und kein Unterschied im Cue-Ton-Test (Zusatzdatei 3: Abb. S1E links, n = 9, P = 0,301 für Männer; Zusatzdatei 3: Abb. S1E rechts, n = 6 –10, P = 0,949 für Frauen) wurden bei beiden Geschlechtern von Ratten beobachtet, die LPS erhielten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass schwere Entzündungen bei Neugeborenen bei beiden Geschlechtern zu langfristigen kognitiven Beeinträchtigungen führen können.

Die Spiegel proinflammatorischer Zytokine im peripheren Blut wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der LPS-Injektion mittels ELISA untersucht (Abb. 2A). Die Ergebnisse zeigten, dass TNF (Abb. 2B, n = 6, ** P < 0,01), IL-6 (Abb. 2D, n = 6, ** P < 0,01, *** P < 0,001) und IL-1β (Abb. 2F, n = 6, ** P < 0,01, *** P < 0,001) im peripheren Blutserum waren 2 h, 4 h und 6 h nach der LPS-Injektion signifikant erhöht, kehrten jedoch alle auf die Kontrollwerte zurück 24 Stunden nach der LPS-Injektion (Abb. 2B, 2D, 2F, n=6, P > 0,05). Anschließend untersuchten wir die Expressionsniveaus dieser proinflammatorischen Zytokine im Hippocampus mittels RT-PCR und Western Blot. Im Vergleich zu den Kontrollratten waren die mRNA-Expressionsniveaus von TNF (Abb. 2C, n = 6, ** P < 0,01) und IL-6 (Abb. 2E, n = 6, ** P < 0,01) deutlich erhöht der Hippocampus 6 Stunden nach der Injektion von LPS, aber beide kehrten bei P5 auf die Kontrollwerte zurück (Abb. 2C, 2E, n = 6, P > 0,05). Bemerkenswert sind die erhöhten Werte von IL-1β-mRNA (Abb. 2G, n = 6, ** P < 0,01) und Protein (Zusatzdatei 3: Abb. S2, n = 6, ** P < 0,01, *** P). < 0,001) blieben mindestens bis P30 erhalten, was darauf hindeutet, dass IL-1β das vorherrschende proinflammatorische Zytokin im ZNS nach schwerer neonataler Entzündung war.

Eine schwere neonatale Entzündung führt zu einem anhaltenden Anstieg von IL-1β im Hippocampus der Ratte. (A) Schematische Darstellung der chronologischen Reihenfolge, die für den proinflammatorischen Zytokintest nach einer neonatalen Entzündung verwendet wird. In dieser Versuchskohorte wurden vierzehn Würfe verwendet. (B, D, F) ELISA-Ergebnisse, die die Proteinspiegel von TNF (B), IL-6 (D) und IL-1β (F) im peripheren Blutserum nach 2 Stunden (n = 6), 4 Stunden (n = 6), 6 h (n = 6) und 24 h (n = 6). (C, E, G) PCR-Ergebnisse, die die mRNA-Spiegel von Hippocampus-TNF (C) und IL-6 (E) 6 Stunden nach der LPS-Injektion (n = 6), P5 (n = 6), P7 (n = 6) zeigen ) und P14 (n = 6) und IL-1β nach LPS-Injektion (G) nach 6 Stunden (n = 6), P5 (n = 6), P7 (n = 6), P14 (n = 6), und P30 (n = 6). LPS: Lipopolysaccharid, NS: Normale Kochsalzlösung. Die Panels B, C, D, E, F und G wurden mit dem ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test oder dem Mann-Whitney-U-Test verglichen. ** P < 0,01 und *** P < 0,001, ns: keine Signifikanz; Fehlerbalken zeigen SD an

Um die Rolle des anhaltenden Anstiegs der IL-1β-Spiegel bei neonatalen entzündungsbedingten kognitiven Beeinträchtigungen zu bestimmen, wurde IL-1β-siRNA bilateral in die CA1-Region des Hippocampus injiziert, um die Expression von IL-1β-mRNA zu unterdrücken (Abb. 3A). . Die von IL-1β-siRNA getragene Fluoreszenz wurde in CA1 nachgewiesen (Zusatzdatei 3: Abb. S3A). Die IL-1β-mRNA-Spiegel wurden durch IL-1β-siRNA zwei Tage nach der Injektion signifikant gesenkt (Abb. 3B, n = 6, *** P <0,001). Im Vergleich zur LPS + Kontroll-siRNA-Gruppe war die Fluchtlatenz bei Ratten aus der NS + Kontroll-siRNA (Abb. 3C, *** P < 0,001) und der LPS + IL-1β-siRNA (Abb. 3C, ** P). < 0,01) Gruppen war am Trainingstag 4 der MWM signifikant zurückgegangen. Für den MWM-Test verbesserte die Behandlung mit IL-1β-siRNA die durch neonatale Entzündungen verursachte kognitive Beeinträchtigung signifikant (Abb. 3D-3F, n = 15–24, *P = 0,012, ** P < 0,01, *** P < 0,001). . Es wurde kein signifikanter Unterschied in der mittleren Geschwindigkeit der Ratten zwischen allen drei Gruppen festgestellt (Abb. 3G, n = 15–24, P = 0,611). Für FC zeigten Ratten in der LPS + IL-1β-siRNA-Gruppe nach dem Training (Abb. 3H) ein erhöhtes Einfrieren in Hippocampus-abhängigen Kontexttests im Vergleich zu Ratten in der LPS + Kontroll-siRNA-Gruppe (Abb. 3I, n = 15). –24, ** P < 0,01, *** P < 0,001). Bei Hippocampus-unabhängigen Cue-Ton-Tests wurde kein Unterschied zwischen diesen drei Gruppen beobachtet (Abb. 3J, n = 15–24, P = 0,786). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass anhaltend erhöhte IL-1β-Spiegel zu einer langfristigen kognitiven Beeinträchtigung nach einer neonatalen Entzündung beitragen.

Eine anhaltende Erhöhung der IL-1β-Spiegel im Hippocampus trägt zu einer langfristigen kognitiven Beeinträchtigung nach einer schweren Entzündung des Neugeborenen bei. (A) Schematische Darstellung der chronologischen Reihenfolge, die für die siRNA-Verabreichung, die LPS-Verabreichung und kognitive Tests verwendet wird. In dieser Versuchskohorte wurden acht Würfe verwendet. (B) PCR-Ergebnisse, die die Knockdown-Effizienz von IL-1β-siRNA (n = 6) zeigen. (C) Lernkurve für die Escape-Latenz. (D) Im Zielquadranten verbrachte Zeit (n = 15–24). (E) Im Zielquadranten zurückgelegte Distanz (n = 15–24). (F) Anzahl der Bahnsteigübergänge (n = 15–24). (G) Mittlere Geschwindigkeit während des räumlichen Sondentests (n = 15–24). (H) Die Gefrierzeit von Ratten im FC-Training. (I) Die Gefrierzeit von Ratten im Kontext-FC-Test (n = 15–24). (J) Die Gefrierzeit von Ratten im Cued-FC-Test (n = 15–24). LPS: Lipopolysaccharid; NS: normale Kochsalzlösung; MWM: Morris-Wasserlabyrinth; FC: Angstkonditionierung; Panel B wurde durch einen ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test verglichen; Die Panels C und H wurden durch eine Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen verglichen, gefolgt von einem Bonferroni-Post-hoc-Test; Die Panels D, E, F, G, I und J wurden durch eine einfache ANOVA mit wiederholten Messungen verglichen, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test; ** P < 0,01 und *** P < 0,001, ns: keine Signifikanz; Fehlerbalken zeigen SD an

Zunächst stellten wir fest, ob die KCC2-Expression während der Entwicklung bei Ratten geschlechtsspezifisch war. Die KCC2-Expressionsniveaus stiegen im Hippocampus allmählich von P3 auf P14 an. Die Expressionsniveaus von KCC2 (Zusatzdatei 3: Abb. S4A, n = 6, P > 0,05; Zusatzdatei 3: Abb. S4B, n = 4, P > 0,05) zeigten keinen Geschlechtsunterschied von P3 bis P14. Dann fanden wir heraus, dass die LPS-Injektion bei P3 eine erhöhte Expression von KCC2 bei P7 (Abb. 4B linkes Feld, n = 6, *** P < 0,001) und P14 (Abb. 4B mittleres Feld, n = 6, **) induzierte. * P < 0,001) im Vergleich zur normalen Kontrolle. Es wurde kein Unterschied in der KCC2-Expression (Abb. 4B rechts, n = 6, P > 0,05) bei Ratten bei P30 zwischen der LPS-Gruppe und der Kontrollgruppe gefunden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine neonatale Entzündung das erhöhte Expressionsniveau von KCC2 während der frühen Entwicklung beschleunigen kann.

KCC2 vermittelt die Wirkung von IL-1β auf schwere entzündungsbedingte kognitive Beeinträchtigungen bei Neugeborenen. (A) Schematische Darstellung der chronologischen Reihenfolge, die für die Erstellung des Entzündungsmodells und der KCC2-Level-Tests verwendet wurde. In dieser Versuchskohorte wurden fünf Würfe verwendet. (B) Die Proteinspiegel von KCC2 bei P7- (linkes Feld, n = 6), P14- (mittleres Feld, n = 6) und P30-Ratten (rechtes Feld, n = 6) nach LPS-Injektion. (C) Schematische Darstellung der chronologischen Reihenfolge, die für die siRNA-Injektion, die Etablierung des Entzündungsmodells und die kognitiven Tests verwendet wird. In dieser Versuchskohorte wurden neun Würfe verwendet. (D) Die Knockdown-Effizienz von KCC2-siRNA durch PCR (n = 6). (E) Lernkurve für die Escape-Latenz. (F) Im Zielquadranten verbrachte Zeit (n = 10–15). (G) Im Zielquadranten zurückgelegte Distanz (n = 10–15). (H) Anzahl der Bahnsteigübergänge (n = 10–15). (I) Mittlere Geschwindigkeit während des räumlichen Sondentests (n = 10–15). (J) Die Gefrierzeit von Ratten während des FC-Trainings. (K) Die Gefrierzeit von Ratten im Kontext-FC-Test (n = 10–15). (L) Die Gefrierzeit von Ratten im Cued-FC-Test (n = 10–15). LPS: Lipopolysaccharid; NS: normale Kochsalzlösung; MWM: Morris-Wasserlabyrinth; FC: Angstkonditionierung; Die Panels B und D wurden durch einen ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test verglichen; Die Panels F, G, H, I, K und L wurden durch eine einfache ANOVA mit wiederholten Messungen verglichen, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test; * P < 0,05, ** P < 0,01 und *** P < 0,001, ns: keine Signifikanz; Fehlerbalken zeigen SD an

KCC2-siRNA wurde verwendet, um die Expression von KCC2 in CA1 des Hippocampus zu verringern. Die von KCC2-siRNA getragene Fluoreszenz wurde in CA1 nachgewiesen (Zusatzdatei 3: Abb. S3B). Die Knockdown-Effizienz von KCC2-siRNA wurde durch RT-PCR bestätigt (Abb. 4D, n = 6, *** P <0,001). Die IL-1β-siRNA-Injektion verringerte die Expression von IL-1β im Hippocampus bei P7 (Zusatzdatei 3: Abb. S5A linkes Feld, n = 6–8, *** P <0,001; Zusatzdatei 3: Abb. S6 links Panel, n = 6, *** P < 0,001), P14 (Zusatzdatei 3: Abb. S5A mittleres Panel, n = 6, ** P < 0,01; Zusatzdatei 3: Abb. S6 mittleres Panel, n = 6, ** P < 0,01) und P30 (Zusatzdatei 3: Abb. S5A rechtes Feld, n = 6, * P = 0,037; Zusatzdatei 3: Abb. S6 rechtes Feld, n = 6, * P = 0,013) nach LPS-Injektion auf P3. Die KCC2-siRNA-Injektion verringerte die Expression von KCC2 im Hippocampus bei P7 (Zusatzdatei 3: Abb. S5B linkes Feld, n = 6, * P = 0,025; Zusatzdatei 3: Abb. S7 linkes Feld, n = 6, * P = 0,024) und P14 (Zusatzdatei 3: Abb. S5B Mittelfeld, n = 6, ** P < 0,01; Zusatzdatei 3: Abb. S7 Mittelfeld, n = 6, * P = 0,014) nach LPS-Injektion bei P3 . Darüber hinaus hemmte die Unterdrückung der IL-1β-Expression den Anstieg der KCC2-Expression (Zusatzdatei 3: Abb. S5B linkes und mittleres Feld, n = 6, * P = 0,044 für P7, * P = 0,038 für P14; Zusatzdatei 3: Abb . S7 mittleres Feld, n = 6, * P = 0,037 für P14), induziert durch LPS-Injektion. Dementsprechend wurde die durch schwere neonatale Entzündungen verursachte kognitive Beeinträchtigung durch die Injektion von IL-1β-siRNA und/oder KCC2-siRNA signifikant verbessert (Abb. 4F-4H, 4K, n = 10–15, * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001), was darauf hindeutet, dass die Hemmung der Erhöhung der IL-1β- und/oder KCC2-Expression während der Periode der GABAergen Entwicklung die langfristige kognitive Beeinträchtigung verhindern konnte, die durch schwere neonatale Entzündungen verursacht wird.

Als nächstes befassten wir uns mit den Auswirkungen neonataler Entzündungen auf die intrinsischen elektrophysiologischen Eigenschaften der CA1-Pyramidenneuronen von Ratten bei P7-P10, P14-P16 und P28-P32 (Abb. 5A). Das GABA-Umkehrpotential (EGABA) wurde bestimmt, um die Veränderungen der Chloridhomöostase von CA1-Schnitten nach einer schweren Entzündung des Neugeborenen direkt zu testen. Eine neonatale Entzündung verursachte eine signifikante hyperpolarisierende Verschiebung von EGABA sowohl bei P7-P10 (Abb. 5B-5D, n = 10–12 Zellen von 4–5 Ratten, *** P < 0,001) als auch bei P14-P16 (Abb. 5F-5H). , n = 7 Zellen von 3–4 Ratten, ** P < 0,01), begleitet von einem hyperpolarisierten Ruhemembranpotential (RMP) (Abb. 5E, n = 9–14 Zellen von 5–6 Ratten, ** P < 0,01 ; Abb. 5I, n= 10–13 Zellen von 4–5 Ratten, ** P < 0,01). Die Unterdrückung der IL-1β-Expression oder der KCC2-Expression linderte die durch neonatale Entzündungen verursachte hyperpolarisierende Verschiebung in EGABA (Abb. 5M-5O, n = 7–8 Zellen von 3–4 Ratten, * P = 0,02 vs. LPS + IL-1β- siRNA-Gruppe, * P = 0,033 vs. LPS + KCC2-siRNA-Gruppe; Abb. 5Q-5R, n = 5–7 Zellen von 3–4 Ratten, * P = 0,02, ** P < 0,01) und hyperpolarisiertes RMP (Abb . 5P, n = 7–11 Zellen von 4–5 Ratten, * P = 0,025 vs. LPS + IL-1β-siRNA-Gruppe, * P = 0,023 vs. LPS + KCC2-siRNA-Gruppe; Abb. 5S, n = 7 –9 Zellen von 3–4 Ratten, * P = 0,022 vs. LPS + IL-1β-siRNA-Gruppe, * P = 0,011 vs. LPS + KCC2-siRNA-Gruppe) sowohl bei P7-P10 als auch bei P14-P16. Es wurde kein signifikanter Unterschied im EGABA (Abb. 5J-5K, n = 6–7 Zellen von 3–4 Ratten, P > 0,05) oder im RMP (Abb. 5L, n = 8–10 Zellen von 4–5 Ratten) festgestellt , P > 0,05) bei P28-P32-Ratten zwischen der LPS- und der Kontrollgruppe.

EGABA ist in CA1-Pyramidenneuronen von Ratten nach einer schweren neonatalen Entzündung hyperpolarisiert. (A) Schematische Darstellung der chronologischen Reihenfolge, die für die siRNA-Lieferung, die LPS-Verabreichung und die perforierten Patch-Aufzeichnungen verwendet wird. In dieser Versuchskohorte wurden fünfzehn Würfe verwendet. (B) Repräsentative Spuren von GABA-induzierten Strömen zum Haltepotential von –80 bis –30 mV in 10-mV-Schritten von Hippocampus-Neuronen bei P7-P10. (C) Strom-Spannungs-Kurve (IV) von GABA-induzierten Strömen, aufgezeichnet bei verschiedenen Haltepotentialen von –80 bis –30 mV in 10-mV-Schritten von Pyramidenneuronen bei P7-P10. (D) EGABA-Werte pro Zelle, die aus allen IV-Kurven erhalten wurden, was auf eine hyperpolarisierende Verschiebung bei septischen Ratten bei P7-P10 hinweist (n = 10–12 Zellen von 4–5 Ratten). (E) RMP-Werte, die eine hyperpolarisierende Verschiebung bei septischen Ratten bei P7–10 zeigen (n = 9–14 Zellen von 5–6 Ratten). (F) Repräsentative Spuren von GABA-induzierten Strömen zum Haltepotential von –80 bis –30 mV in 10-mV-Schritten von Hippocampus-Neuronen bei P14-P16. (G) Strom-Spannungs-Kurve (IV) von GABA-induzierten Strömen, aufgezeichnet bei verschiedenen Haltepotentialen von – 80 bis – 30 mV in 10-mV-Schritten von Pyramidenneuronen bei P14. (H) EGABA-Werte pro Zelle, die aus allen IV-Kurven erhalten wurden, was auf eine hyperpolarisierende Verschiebung bei septischen Ratten bei P14-P16 hinweist (n = 7 Zellen von 3–4 Ratten). (I) RMP-Werte, die eine hyperpolarisierende Verschiebung bei septischen Ratten bei P14–P16 zeigen (n = 10–13 Zellen von 4–5 Ratten). (J) Strom-Spannungs-Kurve (IV) spontaner GABA-induzierter Ströme, aufgezeichnet bei verschiedenen Haltepotentialen von –80 bis –30 mV in 10-mV-Schritten von Pyramidenneuronen bei P28-P32. (K) EGABA-Werte pro Zelle, die aus allen IV-Kurven erhalten wurden, was auf eine hyperpolarisierende Verschiebung bei septischen Ratten bei P28–32 hinweist (n = 6–7 Zellen von 3–4 Ratten). (L) RMP-Werte, die eine hyperpolarisierende Verschiebung bei septischen Ratten bei P28-P32 zeigen (n = 8–10 Zellen von 4–5 Ratten). (M) Repräsentative Spuren von GABA-induzierten Strömen zum Haltepotential von –80 bis –30 mV in 10-mV-Schritten von Hippocampus-Neuronen bei P7-P10 nach siRNA-Injektion. (N) Strom-Spannungs-Kurve (IV) von GABA-induzierten Strömen, aufgezeichnet bei verschiedenen Haltepotentialen von – 80 bis – 30 mV in 10-mV-Schritten von Pyramidenneuronen bei P7-P10 nach siRNA-Injektion. (O) EGABA-Werte pro Zelle, erhalten aus allen IV-Kurven bei P7-P10 nach siRNA-Injektion (n = 7–8 Zellen von 3–4 Ratten). (P) RMP-Werte bei P7-P10 nach siRNA-Injektion (n = 7–11 Zellen von 4–5 Ratten). (Q) Strom-Spannungs-Kurve (IV) von GABA-induzierten Strömen, aufgezeichnet bei verschiedenen Haltepotentialen von – 80 bis – 30 mV in 10-mV-Schritten von Pyramidenneuronen bei P14-P16 nach siRNA-Injektion. (R) EGABA-Werte pro Zelle, erhalten aus allen IV-Kurven bei P14-P16 nach siRNA-Injektion (n = 5–7 Zellen von 3–4 Ratten). (S) RMP-Werte bei P14-P16 nach siRNA-Injektion (n = 7–9 Zellen von 3–4 Ratten). LPS: Lipopolysaccharid; NS: normale Kochsalzlösung; EGABA: GABA-Umkehrpotenzial; Die Panels D, E, H, I, K und L wurden mit einem ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test verglichen; Die Panels O, P, R und S wurden durch eine einfache ANOVA mit wiederholten Messungen verglichen, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test; * P < 0,05, ** P < 0,01 und *** P < 0,001, ns: keine Signifikanz; Fehlerbalken zeigen SD an

Die vorliegende Studie zeigt, dass eine schwere neonatale Entzündung bei jugendlichen Ratten durch eine Hochregulierung der IL-1β/KCC2-Signalübertragung während der Neugeborenenentwicklung zu einer langanhaltenden kognitiven Beeinträchtigung führen kann, begleitet von einer beschleunigten GABAergen Verschiebung von der Depolarisierung zur Hyperpolarisierung.

Es ist allgemein anerkannt, dass ZNS-Entzündungen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung einer langanhaltenden kognitiven Beeinträchtigung nach einer frühen Entzündung spielen [35, 36]. Proinflammatorische Zytokine, insbesondere IL-1β, spielen eine wichtige Rolle im ZNS-Entzündungsprozess nach einer neonatalen Entzündung [16, 17]. Darüber hinaus ist bekannt, dass IL-1β das Hippocampus-abhängige Gedächtnis und Lernen beeinflusst [37]. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen [10] zeigten unsere Ergebnisse, dass IL-1β, nicht jedoch IL-6 und TNF, mindestens bis zum 30. postnatalen Tag nach der LPS-Injektion bei P3 auf einem hohen Niveau gehalten wurde. Bemerkenswert ist, dass die Unterdrückung der IL-1β-Expression die langanhaltende kognitive Beeinträchtigung, die durch eine neonatale Entzündung hervorgerufen wurde, deutlich linderte, was die wichtige Rolle anhaltend erhöhter IL-1β-Spiegel bei dieser Störung bestätigt.

GABA depolarisiert unreife Neuronen in den frühen postnatalen Tagen [38, 39]. Während der neuronalen Reifung kommt es zu einer GABA-vermittelten funktionellen Verschiebung von der Depolarisierung zur Hyperpolarisierung durch Hochregulierung des Chlorid-Exporteurs KCC2, was zu einer negativen Verschiebung des Umkehrpotentials für Chloridionen führt [20, 38, 40]. Beleidigungen während solcher Entwicklungszeitfenster können langfristige Folgen haben [27, 40]. Hier schlugen wir vor, dass eine neonatale Entzündung die Expression von KCC2 verändern und somit die GABAerge Verschiebung während der Entwicklung beeinflussen könnte, was zu einer langanhaltenden kognitiven Beeinträchtigung beitragen könnte. Wie erwartet zeigten unsere Ergebnisse, dass eine neonatale Entzündung die Expression von KCC2 erhöhte und somit eine niedrigere Konzentration an intrazellulärem Cl– aufrechterhielt, was durch ein hyperpolarisiertes EGABA belegt wurde. Bemerkenswerterweise linderte die Unterdrückung der KCC2-Expression die durch neonatale Entzündungen verursachte kognitive Beeinträchtigung und kehrte die hyperpolarisierte EGABA um. Um festzustellen, ob KCC2 ein Downstream-Ziel von IL-1β ist, untersuchten wir die KCC2-Expression und EGABA nach IL-1β-siRNA-Injektion bei LPS-Ratten. Infolgedessen kann die Unterdrückung der Expression von IL-1β die veränderte Expression von KCC2 und EGABA umkehren. Daher deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Hochregulierung von KCC2 während der Entwicklung die Auswirkungen erhöhter IL-1β-Spiegel auf eine langanhaltende kognitive Beeinträchtigung vermittelt. Während Corradini et al. berichteten, dass eine mütterliche Infektion mit Polyinosin-Polycytidylsäure (PolyI:C) eine Herunterregulierung der KCC2-Transkription im Kortex von Nachkommenmäusen verursacht, was zu einer verzögerten GABAergen Verschiebung von exzitatorisch zu inhibitorisch und einer höheren Anfälligkeit für Anfälle in vivo führt, die bis zum Erwachsenenalter anhält [27]. Diese Anomalien wurden bei Knockout-Mäusen mit Interleukin-1-Rezeptor Typ I nicht beobachtet [27]. Ihre Ergebnisse scheinen im Widerspruch zu unseren Ergebnissen zu stehen, was auf die unterschiedlichen Gehirnregionen und Zeitfenster der Entzündung zurückzuführen sein könnte. Frühere Studien haben bestätigt, dass die Funktion der GABAergen Übertragung von der Region abhängt, beispielsweise vom Kortex im Vergleich zum Hippocampus [18,19,20]. Darüber hinaus könnte auch die höhere LPS-Dosis, die in der vorliegenden Studie verwendet wurde, zu dieser Diskrepanz beitragen. Zusammenfassend lassen sowohl ihre Ergebnisse als auch unsere Ergebnisse hier auf einen Zusammenhang zwischen IL-1β/KCC2 und der GABAergen Verschiebung während der Entwicklung schließen; und bestätigten, dass die abnormale GABAerge Verschiebung, sei es Beschleunigung oder Verzögerung, zu neurologischen Entwicklungsstörungen führen kann.

Gomez et al. fanden heraus, dass eine Entzündung im frühen Leben die Erregbarkeit von CA1-Pyramidenneuronen bei erwachsenen männlichen Mäusen erhöht, was durch ein depolarisiertes GABA-Umkehrpotential infolge einer erhöhten Expression von NKCC1 gezeigt wird [13]. Daher unterstreichen sowohl ihre Ergebnisse als auch unsere Ergebnisse die Rolle der Chloridhomöostase für die langanhaltenden intrinsischen Membraneigenschaften in Hippocampus-Neuronen nach einer frühen Entzündung, obwohl einige Diskrepanzen bestehen. In unserer vorliegenden Studie konnten wir keinen signifikanten Geschlechtsunterschied bei schweren, entzündungsbedingten langfristigen kognitiven Beeinträchtigungen bei Neugeborenen beobachten. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass die Hochregulierung von KCC2 die kausale Rolle spielt. Die Zeitpunkte der LPS-Verabreichung könnten die Hauptursache für die Diskrepanz sein: In der Studie von Gomez [13] wurde eine neonatale Entzündung durch LPS-Injektion am 14. postnatalen Tag (P14) induziert [13], wohingegen das LPS in dieser vorliegenden Studie am P3 injiziert wurde. In der Studie von Gomez et al. [13], Patch-Aufzeichnungen von CA1-Hippocampus-Pyramidenneuronen wurden im Jugendalter (P35–P45) oder im Erwachsenenalter (P60–P70) durchgeführt und zeigten eine depolarisierte EGABA. Während dieser Studie wurden Patch-Aufzeichnungen bei P7-P10 und/oder P14-P16 aufgezeichnet und zeigten eine hyperpolarisierte EGABA. Frühere Erkenntnisse zeigten, dass die GABAerge Verschiebung nach P14 möglicherweise fast abgeschlossen war [20]; Daher kann eine im Frühstadium induzierte Entzündung im Vergleich zu einem fast vollständigen Stadium der GABAergen Verschiebung zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Darüber hinaus können Entzündungen im höheren Alter und in der Nähe von Heranwachsenden dazu neigen, geschlechtsabhängige kognitive Störungen zu verursachen. Bemerkenswert ist, wie oben erwähnt, dass die in der vorliegenden Studie verwendete höhere LPS-Dosis möglicherweise auch zu dieser Diskrepanz beiträgt. Im Gegensatz zur LPS-Dosis (0,1 mg kg-1, ip) in der Studie von Gomez [13] und einer anderen Studie [41] verwendeten wir eine höhere LPS-Dosis (1 mg kg-1, ip), was zu ~ 40 % führte. Mortalität. Daher ähnelt eine so hohe LPS-Dosis eher einem Sepsis-Modell als einer neonatalen Entzündung. Wichtig ist, dass wir Verhaltensexperimente durchgeführt und gezeigt haben, dass die Hochregulierung von KCC2 und die beschleunigte GABAerge Verschiebung einen wichtigen Beitrag zu kognitiven Beeinträchtigungen leisten, die durch neonatale Entzündungen verursacht werden. Eine Einschränkung besteht darin, dass wir nicht getestet haben, ob ein ähnlicher Effekt bei erwachsenen Ratten beobachtet wurde, wie von Gomez und Kollegen berichtet [13]. Zukünftige Studien müssen untersuchen, ob die Wirkung neonataler Entzündungen auf ein bestimmtes Zeitfenster begrenzt ist.

Neben KCC2 spielt auch NKCC1 eine zentrale Rolle bei der neuronalen Entwicklung unreifer Gehirne [18, 42]. Es wurde vermutet, dass NKCC1 ein wichtiges therapeutisches Ziel für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen ist. Beispielsweise war eine kognitive Beeinträchtigung in einem Mausmodell der Schizophrenie mit dem Umkehrpotenzial von GABAA-Strömen in Pyramidenneuronen des infralimbischen präfrontalen Kortex verbunden, das aus einer erhöhten Expression von NKCC1 resultierte, die durch Bumetanid verbessert werden konnte [43]. In einem Mausmodell des Down-Syndroms rettet der NKCC1-Knockdown in vivo kognitive Defizite bei verschiedenen Verhaltensaufgaben [44]. Die Behandlung mit Bumetanid, einem NKCC1-Antagonisten, während einer anfälligen Entwicklungsphase rettet Epilepsie in einem Mäusemodell mit genetischer Epilepsie [45]. Darüber hinaus haben Gomez und Kollegen die Rolle von NKCC1 bei den durch Entzündungen im frühen Leben verursachten intrinsischen Membraneigenschaften in Neuronen des Hippocampus bestätigt [13]. Eine Studie ergab jedoch, dass NKCC1 in telenzephalen glutamatergen Neuronen für wichtige Aspekte der Hippocampus-Entwicklung nicht essentiell zu sein scheint [46]. In zukünftigen Studien wird es interessant sein, die Rolle von NKCC1 bei der durch Entzündungen bei Neugeborenen verursachten kognitiven Beeinträchtigung zu bestimmen.

In der vorliegenden Studie wurden Ratten sowohl auf Hippocampus-abhängige kontextuelle als auch auf Hippocampus-unabhängige Cued-Angst-Konditionierung getestet [47]. Eine schwere neonatale Entzündung beeinflusste die Hippocampus-abhängige kontextuelle, aber nicht ausgelöste Angstkonditionierung. Diese Daten unterstreichen zusammen mit den räumlichen Lern- und Gedächtnisergebnissen, die durch die Hippocampus-abhängigen Morris-Wasserlabyrinth-Kognitionstests ermittelt wurden, die Bedeutung des Hippocampus bei schweren, entzündungsbedingten, langanhaltenden kognitiven Beeinträchtigungen bei Neugeborenen.

Die Expression von KCC2 und EGABA kehrte bei heranwachsenden Ratten nach einer neonatalen Entzündung auf die Kontrollwerte zurück, was die Frage aufwirft, was die direkte Ursache einer langfristigen kognitiven Dysfunktion zum Zeitpunkt der Verhaltensmessung ist. Obwohl die vorliegende Studie keine direkten Daten vorlegte, ist es möglich, dass KCC2 vielfältige modulatorische Rollen in der neuronalen Entwicklung spielt, die sich auf kognitive Funktionen beziehen, hauptsächlich einschließlich der Festlegung der Stärke und Polarität von GABA-Strömen während der neuronalen Reifung und der Regulierung der Zytoskelettdynamik über seinen C-Terminus Domäne, moduliert die Entwicklungsapoptose, kontrolliert die frühen Netzwerkereignisse und ist an der Bildung und Plastizität kortikaler dendritischer Stacheln beteiligt [18]. Daher kann jede Abnormalität in einer der oben genannten Funktionen zu den durch Entzündungen des Neugeborenen verursachten langfristigen kognitiven Defekten beitragen. Beispielsweise ist es möglich, dass frühe Entzündungen und/oder GABAerge Verschiebungen die Entwicklung einer erregenden glutamatergen Übertragung beeinflussen [20, 48] und so zu einer beeinträchtigten glutamatergen Funktion im Jugendalter führen. Zukünftige Studien müssen untersuchen, warum eine Hochregulierung von KCC2 in der frühen Entwicklungsphase zu einer langfristigen kognitiven Beeinträchtigung im Jugendalter oder sogar im Erwachsenenalter führt.

Es ist zu beachten, dass es bekannte Auswirkungen des Transports auf trächtige Muttertiere gibt [49, 50]. Daher wird der Transport trächtiger Muttertiere für Entwicklungsstudien nicht empfohlen und sollte in zukünftigen Experimenten vermieden werden. Obwohl in dieser Studie sowohl Kontrolltiere als auch Muttertiere entzündeter Jungtiere gleichermaßen dem Transport ausgesetzt waren, besteht die Möglichkeit, dass eine Wechselwirkung zwischen dem Transportstress und der LPS-induzierten Entzündung besteht.

Zusammenfassend verdeutlichen unsere Ergebnisse einen mechanistischen Zusammenhang zwischen der Expression von IL-1β/KCC2 und langanhaltender kognitiver Beeinträchtigung in einem Modell schwerer neonataler Entzündungen und stellen ein zugrunde liegendes molekulares Ziel zur Vorbeugung und/oder Behandlung kognitiver Störungen nach früher septischer Entzündung dar.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Zentrales Nervensystem

GABA-Umkehrpotential

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Angstkonditionierung

γ-Aminobuttersäure

Interleukin-1 Beta

K+-Cl– Co-Transporter 2

Lipopolysaccharid

Morris-Wasserlabyrinth

Na+-K+-2Cl– Co-Transporter 1

Normale Kochsalzlösung

Postnataler Tag 3

Ruhemembranpotential

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Referenzen herunterladen

Unzutreffend.

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse Nr. 82071687 (an Han Huang) und Nr. 81974164 (an Cheng Zhou) von der National Natural Science Foundation of China unterstützt; Stipendium Nr. 2021M692276 (an Donghang Zhang) von der China Postdoctoral Science Foundation; und Zuschuss Nr. 21PJ014 (an Donghang Zhang) von der Gesundheitskommission des Programms der Provinz Sichuan.

Donghang Zhang, Yujiao Yang und Yaoxin Yang haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für Anästhesiologie, West China Hospital der Sichuan-Universität, Chengdu, 610041, China

Donghang Zhang, Yaoxin Yang, Jin Liu und Tao Zhu

Labor für Anästhesie und Intensivmedizin, Nationales und lokales gemeinsames technisches Forschungszentrum für translationale Medizin der Anästhesiologie, Westchinesisches Krankenhaus der Sichuan-Universität, Chengdu, 610041, China

Donghang Zhang, Yaoxin Yang, Jin Liu und Cheng Zhou

Abteilung für Anästhesiologie, angegliedertes Krankenhaus des North Sichuan Medical College, Nanchong, 637000, China

Yujiao Yang

Abteilung für Anästhesiologie und Schlüssellabor für Geburtsfehler und verwandte Krankheiten von Frauen und Kindern, Bildungsministerium, Westchinesisches Zweites Krankenhaus der Sichuan-Universität, Chengdu, 610041, China

Han Huang

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CZ und HH haben zum Studiendesign beigetragen. DZ, YY1 und YY2 trugen zur Studiendurchführung bei. CZ, DZ, JL und TZ haben zur Datenanalyse beigetragen. CZ, DZ und HH haben das Manuskript verfasst. Alle Autoren haben das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Han Huang oder Cheng Zhou.

Das Versuchsprotokoll wurde von der Tierethikkommission des West China Hospital der Sichuan-Universität (Ref: 2020013) (Chengdu, Sichuan, China) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien „Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments“ (ARRIVE) durchgeführt. In diese Studie wurden keine Menschen einbezogen.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Originalbilder für Western-Blot-Ergebnisse.

Tisch. S1: Statistische Informationen zu Abb. 1. Tabelle. S2: Statistische Informationen zu Abb. 2. Tabelle. S3: Statistische Informationen zu Abb. 3. Tabelle. S4: Statistische Informationen zu Abb. 4. Tabelle. S5: Statistische Informationen zu Abb. 5. Tabelle. S6: Statistische Informationen zur ergänzenden Abbildung 1. Tabelle. S7: Statistische Informationen zur ergänzenden Abbildung 2. Tabelle. S8: Statistische Informationen zur ergänzenden Abbildung 4. Tabelle. S9: Statistische Informationen zur ergänzenden Abbildung 5. Tabelle. S10: Statistische Informationen zur ergänzenden Abbildung 6. Tabelle. S11: Statistische Informationen zur ergänzenden Abbildung 7.

Abb. S1: MWM-Aufgabe und FC-Test für männliche und weibliche Ratten nach neonataler Entzündung. Abb. S2: Western-Blot-Ergebnisse, die die Proteinspiegel von Hippocampus-IL-1β bei P7, P14 und P30 nach LPS-Exposition zeigen. Abb. S3: Repräsentative Bilder, die die von IL-1β-siRNA oder KCC2-siRNA getragene Fluoreszenz zeigen. Abb. S4: Die mRNA- und Proteinspiegel von KCC2 im Hippocampus mit Entwicklung bei Ratten beiderlei Geschlechts. Abb. S5: Die mRNA-Spiegel von Hippocampus-IL-1β und KCC2 bei P7-, P14- und P30-Ratten nach siRNA-Injektion. Abb. S6: Die Proteinspiegel von Hippocampus-IL-1β bei P7-, P14- und P30-Ratten nach siRNA-Injektion. Abb. S7: Die Proteinspiegel von hippocampalem KCC2 bei P7-, P14- und P30-Ratten nach siRNA-Injektion.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, D., Yang, Y., Yang, Y. et al. Schwere Entzündungen bei Neugeborenen führen durch die Aktivierung der IL-1β/KCC2-Signalübertragung während der frühen Entwicklung zu einer langfristigen kognitiven Beeinträchtigung. BMC Med 20, 235 (2022). https://doi.org/10.1186/s12916-022-02434-w

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Eingegangen: 07. März 2022

Angenommen: 13. Juni 2022

Veröffentlicht: 27. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-022-02434-w

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