Transkriptomanalyse von AAV

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 19395 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Retinopathien sind multifaktorielle Erkrankungen mit komplexen Pathologien, die schließlich zum Verlust des Sehvermögens führen. Tiermodelle erleichtern das Verständnis der Pathophysiologie und die Identifizierung neuer Behandlungsmöglichkeiten. Allerdings spiegelt jedes Tiermodell nur spezifische Krankheitsaspekte wider und das Verständnis der spezifischen molekularen Veränderungen in den meisten Krankheitsmodellen ist begrenzt. Hier führten wir eine Transkriptomanalyse von murinem Augengewebe durch, das mit rekombinanten Adeno-assoziierten Viren (AAVs) transduziert wurde, die entweder menschliches VEGF-A, TNF-α oder IL-6 exprimierten. Die VEGF-Expression führte zu einer deutlichen Regulierung extrazellulärer Matrix (ECM)-assoziierter Gene. Im Gegensatz dazu führten sowohl TNF-α als auch IL-6 zu vergleichbareren Genexpressionsänderungen in der Interleukin-Signalisierung und der Komplementkaskade, wobei TNF-α-induzierte Veränderungen stärker ausgeprägt waren. Darüber hinaus deutete die Integration von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten auf einen Anstieg endothelzellspezifischer Markergene durch VEGF hin, während die TNF-α-Expression die Expression von T-Zell-Markern erhöhte. Sowohl die TNF-α- als auch die IL-6-Expression führten zu einem Anstieg der Makrophagenmarker. Schließlich überlappten sich die transkriptomischen Veränderungen bei mit AAV-VEGF behandelten Mäusen weitgehend mit den im Modell der sauerstoffinduzierten Retinopathie beobachteten Genexpressionsänderungen, insbesondere im Hinblick auf ECM-Komponenten und die endothelzellspezifische Genexpression. Insgesamt stellt unsere Studie eine wertvolle Untersuchung der durch VEGF, TNF-α und IL-6 induzierten Genexpressionsveränderungen dar und wird Forschern bei der Auswahl geeigneter Tiermodelle für Retinopathien basierend auf ihrer Übereinstimmung mit der menschlichen Pathophysiologie helfen.

Retinopathien wie diabetische Retinopathie (DR), altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Uveitis oder Frühgeborenenretinopathie (ROP) zeigen bei Patienten komplexe Pathologien, darunter Vaskulopathien, Entzündungen, Neurodegeneration und Fibrose, die letztendlich zur Erblindung führen. Eine Reihe molekularer Veränderungen wurden mit diesen Netzhauterkrankungen in Verbindung gebracht, beispielsweise Veränderungen in der Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), des Tumornekrosefaktors Alpha (TNF-α) oder von Interleukin-6 (IL-6). VEGF verursacht Gefäßleckagen und pathologische Neovaskularisation, und es wurde gezeigt, dass VEGF-Protein bei feuchter AMD1, DR2, diabetischem Makulaödem (DME)3 und ROP4 hochreguliert ist. Dementsprechend hat sich die Anti-VEGF-Behandlung als Standardbehandlung bei feuchter AMD5 und DME6 herausgestellt. Ein weiteres gemeinsames Kennzeichen vieler Retinopathien ist eine Entzündung: Proinflammatorische Zytokine wie TNF-α sowie IL-6-Proteine ​​sind im Glaskörper von DR7,8 und Uveitis-Patienten9,10 hochreguliert.

Verschiedene präklinische Nagetiermodelle haben direkt oder indirekt Aufschluss über die Funktion von VEGF, TNF-α oder IL-6 bei Retinopathien gegeben. Ein häufig verwendetes Tiermodell, das Gefäßpathologien anzeigt, ähnlich denen, die bei proliferativen Retinopathien wie feuchter AMD oder ROP beobachtet werden, ist das Modell der sauerstoffinduzierten Retinopathie (OIR)11,12. Transgene Mäuse, die VEGF exprimieren13,14,15, intraokulare Injektion von rekombinantem VEGF-Protein16,17,18 oder rekombinante adeno-assoziierte Viren (AAVs), die VEGF exprimieren19,20,21,22,23 zeigten außerdem, dass VEGF nicht nur notwendig, sondern auch ausreichend ist Vaskulopathien verursachen. Dementsprechend verhindert die Anti-VEGF-Behandlung die Neovaskularisation im OIR-Modell17,24 und diese präklinischen Studien ebneten den Weg für moderne Anti-VEGF-Therapien. Darüber hinaus können entzündliche Prozesse, die bei Patienten mit Retinopathien beobachtet werden, auch bei Nagetieren modelliert werden, beispielsweise durch Uveitis-Mausmodelle wie Endotoxin- oder Antigen-induzierte Uveitis25,26,27 oder transgene Mäuse, denen das Aire-Gen fehlt28,29. In ähnlicher Weise induzieren rekombinante Proteine ​​oder die AAV-vermittelte Expression von TNF-α und IL-6 eine Entzündung im Nagetierauge, obwohl die direkte Funktion von IL-6 umstrittener ist19,30,31,32. Auch hier verbessert eine Anti-TNF-α- oder Anti-IL-6-Behandlung die induzierten Pathologien in verschiedenen Uveitis-Modellen33,34,35.

Im Rahmen der vorklinischen Forschung hat sich der AAV-vermittelte Gentransfer kürzlich als leistungsstarke Methode zur Erstellung neuartiger Tiermodelle herausgestellt. Ein Hauptvorteil von AAVs ist die langfristige Expression eines Transgens auf gewebe- und zelltypspezifische Weise. Zuvor haben wir gezeigt, dass die AAV-vermittelte Expression 1, 3 und 6 Wochen nach der IVT-Injektion zu einer konstanten und langfristigen Expression menschlicher Transgene führt19. Wir haben außerdem gezeigt, dass die AAV-vermittelte Expression von menschlichem VEGF, TNF-α und IL-6 im Mausauge zu signalwegspezifischen, für den Menschen relevanten Netzhautpathologien führt. Kurz gesagt, die AAV-gesteuerte Expression von VEGF induzierte Gefäßleckage und Neovaskularisation. Andererseits aktivierten die proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-6 beide Immunzellen. TNF-α führte zusätzlich zu Vaskulitis, Fibrose und der Entwicklung fibrotischer epiretinaler Membranen.

In den letzten Jahren ermöglichten Sequenzierungstechniken der nächsten Generation eine detaillierte Untersuchung der molekularen Veränderungen bei Retinopathien und führten zu einem besseren Verständnis des Krankheitsverlaufs bei AMD- und DR-Patienten36,37,38. In ähnlicher Weise wurde das Transkriptom mehrerer Nagetiermodelle für Retinopathien sequenziert und analysiert39,40,41,42. Für das OIR-Modell haben mehrere Studien zeitpunktabhängige Veränderungen der Genexpression im Zusammenhang mit Hypoxie, Angiogenese und Entzündungen identifiziert43,44,45,46,47. Allerdings fehlen noch Vergleiche mit anderen Mausmodellen für Retinopathien. Darüber hinaus lieferten moderne Ansätze der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) beispiellose Einblicke in die zelluläre Organisation gesunder und erkrankter Augengewebe von Säugetieren48,49,50,51,52,53,54. Im Detail beschreiben Heng et al. Durch Einzelzellsequenzierung von Aire-/--Mäusen, einem spontanen Uveoretinitis-Modell, wurde gezeigt, dass eine sehr vielfältige Population von Immunzellen in die Netzhaut von Aire-/--Mäusen eindringt und dass Th1-Zellen die wichtigsten Effektor-T-Zellen in diesem Modell darstellen, was das hervorhebt großes Potenzial solcher Einzelzellsequenzierungsansätze. Mit zunehmender Anzahl verfügbarer Massen- und Einzelzelldatensätze im Zusammenhang mit Retinopathien steigt auch das Potenzial, Daten aus verschiedenen Retinopathiemodellen zu integrieren und auf molekularer Ebene zu vergleichen.

In dieser Studie bieten wir eine transkriptomische Analyse intravitreal injizierter rekombinanter AAVs an, die menschliches VEGF, TNF-α oder IL-6 in Mäusen exprimieren. Wir beobachteten, dass die AAV-vermittelte Expression menschlicher Transgene unterschiedliche transkriptomische Reaktionen hervorrief: Während TNF-α und IL6 überlappende Genexpressionsänderungen zeigten, führte die Überexpression von VEGF im Vergleich zu TNF-α und IL-6 zu einer deutlicheren Reaktion. Bei der genaueren Untersuchung von Signalwegen, die von jeder experimentellen Bedingung beeinflusst werden, führte VEGF zu einer spezifischen Regulierung von Genen, die mit der extrazellulären Matrix (ECM) in Zusammenhang stehen, während TNF-α und IL-6 Veränderungen in der Interleukin-Signalisierung induzierten. Wir identifizierten außerdem spezifische Genexpressionsveränderungen im Zusammenhang mit TNF-α, die zelluläre Adhäsionsmoleküle wie Madcam1 umfassten, und zeigten außerdem eine konservierte Regulation von MAdCAM-1 durch TNF-α in menschlichen Netzhautendothelzellen. Durch die Integration von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten konnten wir einen Anstieg von T-Zell-spezifischen Genen nach der TNF-α-Expression zeigen und tatsächlich wurde die TNF-α-vermittelte T-Zell-Invasion durch Immunfluoreszenz validiert. Zusätzlich zur Bewertung der Transkriptomveränderungen in den verschiedenen transgenen Mäusemodellen haben wir einen detaillierten Zeitverlauf der Transkriptomveränderungen im etablierten OIR-Modell erstellt. Beim Vergleich von Transkriptomveränderungen in AAV-Überexpressionsmodellen und OIR-Mäusen beobachteten wir die größte Überlappung zwischen mit AAV-VEGF behandelten Augen und der späten Reaktion (P16) im OIR-Modell, am deutlichsten einschließlich Veränderungen im ECM-Signalweg und in endothelzellspezifischen Markergenen. Zu den OIR-spezifischen Veränderungen in der Genregulation gehörten vor allem neuronale Signalwege, die nach der Expression des AAV-VEGF-Transgens nicht beobachtet wurden. Zusammenfassend legt unsere Studie nahe, dass jedes Tiermodell unterschiedliche Genexpressionsprofile erzeugt und eine sorgfältige Auswahl der Modelle entsprechend den Anforderungen verschiedener Forschungsfragen erforderlich ist.

Um transkriptomische Profile von Augengeweben, die menschliches VEGF, TNF-α und IL-6 exprimieren, zu untersuchen und zu vergleichen, injizierten wir Mäuseaugen intravitreal AAVs, die eines der drei menschlichen Transgene exprimierten (Abb. 1a). Als Kontrollen verwendeten wir Augen mit AAV-Injektion in entsprechenden Konzentrationen und Augen ohne Injektion. Beachten Sie, dass AAV-VEGF mit einer niedrigeren Virusdosis (1 × 108 VG/Auge) injiziert wurde, während AAV-TNF-α und AAV-IL-6 mit 1 × 109 VG/Auge injiziert wurden. Die Augen aller Tiere wurden direkt vor der Gewebesektion und der RNA-Sequenzierung in vivo abgebildet, um die erwarteten Pathologien und den Schweregrad des Phänotyps zu validieren. In Übereinstimmung mit unserer zuvor veröffentlichten Studie19 verursachten AAV-Stuffer-Injektionen bei beiden Konzentrationen keine offensichtlichen Netzhautpathologien, basierend auf der Bildgebung mit blauer Autofluoreszenz (BAF) (ergänzende Abbildung 1), der Fundus-Fluorescein-Angiographie (FFA, ergänzende Abbildung 2) und optisch Kohärenztomographie (OCT, ergänzende Abbildung 3), abgesehen von wenigen unregelmäßigen helleren oder dunkleren Bereichen unbekannter Herkunft in den BAF-Bildern. Die AAV-VEGF-Injektion in 3 von 6 Proben führte zu vergrößerten und abnormal wachsenden Gefäßen und Gefäßlecks, wie in den FFA-Bildern zu sehen ist (ergänzende Abbildung 2). Mit AAV-TNF-α injizierte Augen zeigten zelluläre Infiltrate im Glaskörper, wie in den OCT-Scans gezeigt (ergänzende Abbildung 3). Schließlich zeigten AAV-IL-6-injizierte Augen in der BAF-Bildgebung subretinale Hyperfluoreszenzherde (ergänzende Abbildung 1).

Die AAV-vermittelte Expression von menschlichem VEGF, TNF-α oder IL-6 führt zu deutlichen Transkriptomveränderungen. (a) Experimentelles Design: Netzhaut- und Augenmuschelgewebe für die RNA-Sequenzierung aus 6 Behandlungsgruppen (nicht injiziert, AAV-Stuffer niedrig, AAV-Stuffer hoch, AAV-VEGF, AAV-TNF-α und AAV-IL-6) wurden 3 Wochen nach der IVT und der In-vivo-Bildgebung gesammelt. Das Bild wurde mit BioRender erstellt. (b) Spezifische Expression der menschlichen Transgene VEGF, TNF-α und IL-6 in den jeweiligen Behandlungsgruppen sowohl im Netzhaut- als auch im Augenmuschelgewebe (CPM: Counts Per Million). (c) In-situ-Hybridisierung mithilfe der RNAscope-Technologie zeigte die Expression der drei menschlichen Transgene (rosa Pfeile) im Ziliarkörper (oberes Bild) und in der inneren Schicht der zentralen Netzhaut (unteres Bild). Beachten Sie die abnormalen Endothelzellen um den Ziliarkörper in mit AAV-VEGF behandelten Augen (schwarze Pfeilspitze) und die infiltrierenden Immunzellen in mit AAV-TNF-α behandelten Augen (schwarzer Pfeil). (d) PCA zeigte große Unterschiede zwischen Geweben (oberes Feld) und spezifische Veränderungen, die durch VEGF, TNF-α bzw. IL-6 in jedem Gewebe hervorgerufen wurden (untere Felder). Niedrige Dosis = 1 × 108 VG/Auge; Hohe Dosis = 1 × 109 VG/Auge. Der Prozentsatz der durch die beiden ersten Hauptkomponenten erklärten Varianz wird zusammen mit den jeweiligen x- und y-Beschriftungen angezeigt.

Von allen sechs Behandlungsgruppen wurde Gesamt-RNA aus der Netzhaut und der hinteren Augenmuschel extrahiert, einschließlich des retinalen Pigmentepithels (RPE), der Aderhaut, der Sklera und des Ziliarkörpers. Abgesehen von zwei Proben, die aufgrund einer niedrigen RNA-Integritätszahl (RIN) ausgeschlossen wurden, wurden sechs biologische Replikate pro Gruppe sequenziert. Sequenzierungsbibliotheken wurden mit einer durchschnittlichen Tiefe von 31,3 Millionen Lesevorgängen sequenziert, mit einer Zuordnung von 80,1 % zu mRNA-Transkripten und einem geringen Ribosomengehalt (2,1 %), was auf eine insgesamt gute Qualität der RNA-Sequenzierungsdaten schließen lässt. Wie erwartet zeigten menschliche Transgene in ihren jeweiligen Behandlungsgruppen eine starke Expression (Abb. 1b). Obwohl beschrieben wird, dass das in dieser Studie verwendete ShH10-Kapsid hauptsächlich Müller-Glia55 infiziert, stellten wir vergleichbare Expressionsniveaus von Transgenen sowohl in der Netzhaut als auch in der Augenmuschel fest, was wir für das VEGF-Transgen durch qRT-PCR bestätigten (ergänzende Abbildung 4a). Um alle wichtigen Zelltypen zu identifizieren, die durch das ShH10-Kapsid transduziert wurden, führten wir eine In-situ-Hybridisierung mithilfe der RNAscope-Technologie an histologischen Querschnitten von Mäuseaugen durch, denen AAV-VEGF, AAV-TNF-α und AAV-IL-6 injiziert wurden (Abb . 1c). In Übereinstimmung mit der Literatur55 war die starke und spezifische Expression von Transgenen auf den inneren Teil der Netzhaut beschränkt (vermutlich retinale Ganglienzellen und Müller-Glia). Da in mit AAV-Stuffer-Kontrolle behandelten Augen keine mRNA-Färbung beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 4b), kamen wir zu dem Schluss, dass die zum Nachweis der drei jeweiligen Transgene verwendeten Sonden spezifisch waren. Innerhalb der Augenmuschel wurde keine Expression menschlicher Transgene im RPE- oder Aderhautgewebe beobachtet. Wir stellten jedoch eine starke Expression im Ziliarkörper fest, was darauf hindeutet, dass die mittels RNA-Seq in den Augenmuschelproben gemessene Genexpression vom Ziliarkörper stammte (Abb. 1c).

Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigte die größte Varianz in der Genexpression zwischen Netzhaut- und Augenmuschelproben (Abb. 1d, linkes Feld). Innerhalb des Netzhautgewebes beobachteten wir eine weitere Trennung der Proben zwischen den drei Hauptbehandlungsgruppen und sowohl den AAV-Stuffer-Kontrollen als auch den nicht injizierten Kontrollen (Abb. 1d, mittleres und rechtes Feld). In der PCA erschienen Proben aller drei Kontrollgruppen in unmittelbarer Nähe, was darauf schließen lässt, dass per se keine größeren Veränderungen in der Genexpression durch die IVT-Injektion von AAVs verursacht wurden. Darüber hinaus gruppierten sich AAV-TNF-α- und AAV-IL-6-Proben und zeigten eine gute Trennung von Kontrollproben sowohl im Netzhaut- als auch im Augenmuschelgewebe. AAV-TNF-α-Proben zeigten jedoch insgesamt eine stärkere Trennung von den Kontrollen im Vergleich zu AAV-IL-6. Im Fall von AAV-VEGF stellten wir fest, dass sich vier der AAV-VEGF-Retinaproben deutlich von den Kontroll- und AAV-TNF-α/AAV-IL-6-Proben unterschieden (Abb. 1d). Die verbleibenden zwei Netzhautproben (Replikation 2 + 3) von mit AAV-VEGF behandelten Mäusen zeigten jedoch keine Trennung von den Kontrollen innerhalb der ersten beiden Hauptkomponenten (ergänzende Abbildung 4c, d). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen schienen beide Replikate 2 + 3 basierend auf dem FFA normal zu sein (ergänzende Abbildung 2; ergänzende Abbildung 4c), was darauf hindeutet, dass die Virustransduktion möglicherweise nicht ausreichte, um einen Phänotyp zu verursachen. Da wir in beiden Proben weiterhin eine verringerte Expression von menschlichem VEGF beobachteten (ergänzende Abbildung 4c), haben wir diese beiden Proben aus allen nachfolgenden Analysen entfernt.

Als nächstes untersuchten wir differentiell exprimierte (DE) Gene in den drei Behandlungsgruppen AAV-VEGF, TNF-α und AAV-IL-6 im Vergleich zu ihrer jeweiligen AAV-Stuffer-Kontrolle sowie AAV-Stuffer im Vergleich zu nicht injizierten Kontrollen (Ergänzungstabelle S1). Wie erwartet fanden wir nur wenige signifikante Genexpressionsänderungen zwischen injizierten und nicht injizierten AAV-Stuff-Proben sowohl für die Netzhaut als auch für die Augenmuschel (BH-bereinigter p-Wert <0, 05; Abb. 2a), was wiederum auf eine begrenzte Auswirkung des Kontroll-AAV schließen lässt Injektion auf die Genexpression. Wir beobachteten die größte Anzahl signifikanter Expressionsänderungen im mit TNF-α und IL-6 transfizierten Augenmuschelgewebe, während AAV-VEGF hauptsächlich die Genexpression in der Netzhaut beeinflusste, nicht jedoch das Augenmuschelgewebe. In jeder Behandlungsgruppe gehörte das jeweilige menschliche Transgen zu den signifikant unterschiedlich hochregulierten Genen innerhalb der entsprechenden Behandlungsgruppe, was eine starke AAV-vermittelte Expression sowohl in der Netzhaut als auch in der Augenmuschel bestätigte (Abb. 2b). In Augen, denen AAV-TNF-α injiziert wurde, gehörten zelluläre Adhäsionsmoleküle wie Vcam1 und Madcam1 und Chemokine wie Ccl2 zu den am stärksten deregulierten Genen und unterstützten die bekannte Funktion von TNF-α bei der Regulierung der Immunzelladhäsion an Endothelzellen56. Um die RNA-Sequenzierungsergebnisse zu bestätigen, wurde die Ccl2-Expression durch qRT-PCR validiert, die ähnliche Expressionsmuster mit der höchsten Expression von Ccl2 in mit AAV-TNF-α behandelten Augen zeigte (ergänzende Abbildung 4e, f). Bemerkenswerterweise wurde endogener VEGF in mit AAV-VEGF behandelten Augen herunterreguliert und endogener TNF-α durch AAV-vermittelte Expression von TNF-α oder IL-6 hochreguliert (ergänzende Abbildung 5).

Die Analyse der differentiellen Genexpression ergab verwandte Veränderungen in den mit TNF-α und IL-6 behandelten Augen im Vergleich zu VEGF. (a) Anzahl der unterschiedlich exprimierten Gene bei jeder Behandlung im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen (BH-bereinigter p-Wert < 0,05). (b) Vulkandiagramme, die nach Injektion von AAV-VEGF, AAV-TNF-α oder AAV-IL-6 die am stärksten differenziell regulierten Gene im Netzhaut- und Augenmuschelgewebe anzeigen. (c) Venn-Diagramme, die Sätze unterschiedlich exprimierter Gene darstellen, die sich zwischen Behandlungsgruppen überlappen. 820 Gene wurden durch AAV-VEGF spezifisch reguliert. Große Überlappung zwischen TNF-α- und IL-6-induzierten unterschiedlich regulierten Genen sowohl im Netzhaut- als auch im Augenmuschelgewebe. (d) Die Spearman-Korrelation bestätigte eine starke Korrelation zwischen TNF-α- und IL-6-induzierten Genexpressionsänderungen sowohl im Netzhaut- als auch im Augenmuschelgewebe. Das Dendogramm zeigt eine hierarchische Häufung und daher Ähnlichkeit der durch die Behandlung verursachten Faltungsänderungen im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen.

Um gemeinsame Regulatoren von Netzhauterkrankungen zu finden, aber auch spezifische Signalwege zu identifizieren, die mit den spezifischen Phänotypen korreliert werden können, die durch die drei exprimierten Transgene induziert werden, verglichen wir die transkriptomischen Signaturen von AAV-VEGF, AAV-TNF-α und AAV-IL-6 ( Abb. 2c). Insgesamt wurden im Netzhautgewebe in allen drei AAV-Behandlungsgruppen nur 44 Gene signifikant unterschiedlich reguliert. 820 DE-Gene waren spezifisch für die mit AAV-VEGF behandelte Netzhaut, was weiter auf eine unterschiedliche Transkriptionsreaktion bei AAV-VEGF im Vergleich zu AAV-TNF-α und AAV-IL-6 hinweist. Nur zwei Gene wurden im mit AAV-VEGF behandelten Augenmuschelgewebe signifikant unterschiedlich reguliert, was darauf hindeutet, dass VEGF im vorgestellten AAV-gesteuerten Modell hauptsächlich Netzhautzellen beeinflusst. 1282 und 272 Gene waren DE in AAV-TNF-α- bzw. AAV-IL-6-transduzierten Netzhäuten, wobei 133 Gene zwischen diesen beiden Gruppen überlappten. Darüber hinaus wurden nur 68 Gene spezifisch durch AAV-IL-6 reguliert, aber 966 durch TNF-α in der Netzhaut, was darauf hindeutet, dass ein großer Teil der durch AAV-IL-6 induzierten Genexpressionsänderungen im AAV-TNF-α enthalten waren Antwort. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen wurde die höchste Korrelation der Faltenveränderungen zwischen den mit AAV-TNF-α und AAV-IL-6 behandelten Expressionsprofilen sowohl im Netzhaut- als auch im Augenmuschelgewebe beobachtet, während AAV-VEGF deutlicher erschien (Abb. 2d).

Als nächstes analysierten wir REACTOME-Signalwege, die durch die Behandlung mit AAV-VEGF, AAV-TNF-α oder AAV-IL-6 signifikant beeinflusst wurden (hypergeometrischer Test, BH-bereinigter p-Wert < 0,01). In allen drei Behandlungsgruppen wurde nur ein Signalweg in der Netzhaut angereichert (Abb. 3a), nämlich „Zelloberflächeninteraktionen an der Gefäßwand“ (Abb. 3b). In AAV-VEGF-injizierten Netzhäuten war der am häufigsten deregulierte Signalweg die „Extrazelluläre Matrixorganisation“, während AAV-TNF-α und AAV-IL-6 beide die stärksten Genexpressionsänderungen im Signalweg „Immunregulatorische Wechselwirkungen zwischen einem Lymphoid und einem“ induzierten Nicht-lymphoide Zelle“. Unter den VEGF-spezifischen Signalwegen in der Netzhaut waren „ECM-Proteoglykane“ und Kollagen-bezogene Signalwege deutlich dereguliert. Insgesamt 29 Signalwege wurden spezifisch in TNF-α-injiziertem Netzhautgewebe reguliert, beispielsweise der Signalweg „Rhodopsin-ähnliche Rezeptoren der Klasse A 1“. Zwei Wege wurden speziell in AAV-IL-6-Proben angereichert: „Initial Triggering of Complement“ und „Creation of C4 and C2 activators“. Zu den Signalwegen, die sowohl durch TNF-α als auch durch IL6 reguliert werden, gehörten der „Signalweg durch Interleukine“ und der „Komplementkaskaden“-Weg.

Die Behandlung mit AAV-VEGF veränderte ECM-bezogene Gene, während AAV-TNF-α und AAV-IL-6 eine starke Entzündungsreaktion im Netzhautgewebe hervorriefen. (a) 33 Signalwege wurden spezifisch durch VEGF in der Netzhaut reguliert und ein Großteil der durch IL-6 regulierten Signalwege wurde auch durch TNF-α sowohl im Netzhaut- als auch im Augenmuschelgewebe reguliert. (b) Alle REACTOME-Signalwege waren in mindestens einer der Behandlungen (AAV-VEGF, AAV-TNF-α und AAV-IL-6) signifikant angereichert (BH-bereinigter p-Wert < 0,01).

Da im AAV-VEGF-transduzierten Augenmuschelgewebe nur sehr wenige Gene signifikant unterschiedlich reguliert wurden, wurde im Augenmuschelgewebe nur die Behandlung mit AAV-TNF-α und AAV-IL-6 verglichen (ergänzende Abbildung 6). Auch hier wurden, ähnlich wie bei der Analyse der differentiellen Genexpression, die meisten in AAV-IL-6-Augen identifizierten Signalwege sowohl in der Netzhaut als auch im Augenmuschelgewebe mit AAV-TNF-α gemeinsam genutzt (ergänzende Abbildung 6b).

Der Komplementkaskadenweg ist möglicherweise am Krankheitsverlauf verschiedener Retinopathien, einschließlich AMD5, beteiligt. Wir haben daher die Veränderungen der Genexpression in diesem Signalweg genauer analysiert. Beim Vergleich aller drei Behandlungsgruppen in beiden Geweben wurde die höchste absolute Anzahl von DE-Genen, die mit dem REACTOME-Signalweg „Komplementkaskade“ assoziiert sind, im Augenmuschelgewebe von mit AAV-TNF-α behandelten Augen beobachtet (Abb. 4a). Interessanterweise waren die Komplementaktivatoren C3, Cfp und Cfb in AAV-TNF-α stark hochreguliert, während Komplementinhibitoren wie Cfh oder Cfi in AAV-TNF-α nicht reguliert waren. Im Gegensatz dazu wurden weniger komplementbezogene Gene durch AAV-IL-6 reguliert und beinhalteten eine starke Hochregulierung des Komplementinhibitors Cfi, was auf keine oder eine mildere Aktivierung des Komplementwegs im Vergleich zu AAV-TNF-α hinweist. Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf eine Aktivierung des Komplementwegs in mit AAV-TNF-α behandelten Augen hin. Eines der Gene, das die größte Hochregulierung in Augen mit AAV-TNF-α-Injektion zeigte, war C3 sowohl im Netzhaut- als auch im Augenmuschelgewebe (Abb. 4b). Um unsere Ergebnisse zu validieren, haben wir die C3-Expression mittels ELISA in einer unabhängigen Mauskohorte57 gemessen und die Hochregulierung auch des C3-Proteins 6 Wochen nach der AAV-TNF-α-Behandlung überprüft (Abb. 4c). Darüber hinaus reduzierte der TNF-α-neutralisierende Antikörper Golimumab als Beweis für den Mechanismus die TNF-α-vermittelte Hochregulierung von C3 signifikant (Abb. 4c), was zeigt, dass die C3-Hochregulierung von TNF-α abhängt und in unserem Modell möglicherweise umgekehrt ist .

TNF-α induzierte eine starke Hochregulierung des Komplement-Kaskadenwegs (a). Eine Hochregulierung mehrerer Mitglieder des Komplement-Kaskadenwegs wurde insbesondere in AAV-TNF-α-transduziertem Augenmuschelgewebe beobachtet. Farbige Quadrate in den Spalten auf der linken Seite zeigen signifikante Genexpressionsänderungen mit einem BH-angepassten P-Wert < 0,05 an. (b) Die C3-Expression war in der mit AAV-TNF-α behandelten Netzhaut und Augenmuschel stark hochreguliert. (c) Das C3-Protein wurde auch durch AAV-TNF-α in einer unabhängigen Mäusekohorte 6 Wochen nach der AAV-TNF-α-Behandlung hochreguliert und diese Hochregulierung wurde teilweise durch Anti-TNF-α-Behandlung mit Golimumab aufgehoben (**p < 0,01). ; *p < 0,05, 1-Wege-ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test; n = 3–6), gemessen durch ELISA.

Integrin-Zelloberflächeninteraktionen gehörten zu den wenigen Signalwegen, die sich in den AAV-VEGF- und AAV-TNF-α-Behandlungsgruppen in der Netzhaut signifikant veränderten. Daher waren wir daran interessiert, welche Genexpressionssignaturen zwischen diesen beiden Erkrankungen gemeinsam oder unterschiedlich sind. Innerhalb des Integrin-Zelloberflächeninteraktionswegs beobachteten wir vier verschiedene Cluster: Gene, die sowohl bei AAV-VEGF als auch bei AAV-TNF-α gleichermaßen hochreguliert waren, AAV-VEGF-spezifisch hochreguliert, AAV-TNF-α-spezifisch herunterreguliert und reguliert sowohl in AAV-TNF-α als auch in AAV-IL-6 (Abb. 5a). In der Netzhaut wurden mehrere Kollagene spezifisch in mit AAV-VEGF behandelten Augen hochreguliert, während AAV-TNF-α und AAV-IL-6 beide die Expression von Genen induzierten, die für Integrin-Untereinheiten kodieren. Interessanterweise waren zelluläre Adhäsionsmoleküle (CAMs) wie Icam1, Vcam1 und Madcam1 nur in Augen, denen AAV-TNF-α injiziert worden war, stark hochreguliert (Abb. 5a, b). Madcam1 wurde bereits früher mit TNF-α in Verbindung gebracht und spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung entzündlicher Darmerkrankungen. Allerdings beschreiben nur wenige Studien Madcam1 im Zusammenhang mit Retinopathien, im Gegensatz zu anderen Adhäsionsmolekülen wie Vcam1. Um zu testen, ob MAdCAM-1 auch für menschliche Retinopathien relevant sein könnte, stimulierten wir primäre humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Netzhaut (HRMEC) mit rekombinantem humanem TNF-α. Bemerkenswerterweise erhöhte die TNF-α-Stimulation die Madcam1-Expression in HRMECs stark (Abb. 5c), was darauf hindeutet, dass MAdCAM-1 auch in der menschlichen Netzhaut eine wichtige Rolle spielt und zum Fortschreiten der Krankheit verschiedener menschlicher Retinopathien beitragen könnte.

Zelladhäsionsmoleküle, einschließlich Madcam-1, werden in mit AAV-TNF-α behandelten Augen spezifisch hochreguliert. (a) Spezifische Genexpressionsmuster innerhalb des REACTOME-Signalwegs „Integrin Cell Surface Interactions“ zeigten eine Hochregulierung der Kollagen-Gene durch AAV-VEGF. Die linken Spalten zeigen erneut eine signifikante Genexpressionsänderung mit einem BH-bereinigten P-Wert <0,05. Mitglieder der Integrinfamilie waren hauptsächlich von der Behandlung mit AAV-TNF-α und AAV-IL-6 betroffen, nicht jedoch mit AAV-VEGF. (b) Madcam1 war eines der am stärksten hochregulierten Gene in Augen, denen AAV-TNF-α injiziert wurde, sowohl im Netzhaut- als auch im Augenmuschelgewebe. (c) Die menschliche MADCAM1-Expression wird durch TNF-α-Stimulation menschlicher mikrovaskulärer Endothelzellen der Netzhaut hochreguliert (HRMECs, **p < 0,01, ungepaarter t-Test, n = 3).

Da Massen-RNA-Seq-Daten die Genexpression nicht auf zellspezifischer Ebene auflösen, haben wir kürzlich veröffentlichte RNA-Seq-Studien zu menschlicher Netzhaut und RPE-Einzelzellen48,49,54 genutzt, um durch AAV induzierte zelltypspezifische Veränderungen zu identifizieren -VEGF, AAV-TNF-α und AAV-IL-6. Zu diesem Zweck identifizierten wir zellspezifische Markergene für verschiedene Zelltypen in den scRNA-Seq-Datensätzen von Netzhaut- und RPE-Gewebe und verglichen diese mit den unterschiedlich exprimierten Genen in unserem AAV-induzierten Retinopathiemodell. Im Falle der Heng-Einzelzell-RNA-Seq-Daten haben wir Proben von Wildtyp-Mäusen und Uveitis-ähnlichen Aire-/--Retinae kombiniert, um alle in der gesunden, aber auch entzündeten Retina vorhandenen Zelltypen bestmöglich widerzuspiegeln, ähnlich wie bei unserem AAV-TNF- α- und AAV-IL-6-behandelte Augen. Im Einklang mit den Vaskulopathien, die in mit AAV-VEGF behandelten Augen beobachtet wurden, wurde nach der AAV-VEGF-Behandlung eine signifikante Anreicherung (hypergeometrischer Test, BH-angepasster p-Wert < 0,05) endothelialer und perivaskulärer zellspezifischer Markergene beobachtet (Abb. 6a). , linkes Feld). Im Gegensatz dazu überlappten Monozyten/Makrophagen-spezifische Gene signifikant mit DE-Genen sowohl aus AAV-TNF-α- als auch AAV-IL-6-behandeltem Netzhaut- und Augenmuschelgewebe (Abb. 6a). Interessanterweise war die Anreicherung dieser Immunzellen bei Augen, denen AAV-TNF-α injiziert wurde, stärker als bei Augen, denen AAV-IL-6 injiziert wurde, was mit einer schwereren, durch AAV-TNF-α induzierten Entzündung übereinstimmt, die zuvor beschrieben wurde19. Die Folgeanalyse mit einem zweiten verfügbaren scRNA-Seq-Datensatz49 aus menschlichem Netzhaut- und RPE-Gewebe bestätigte eine signifikante Anreicherung von Makrophagen-/Mikroglia-spezifischen Markern in AAV-TNF-α- und AAV-IL-6-abgeleiteten DE-Genen sowie die Überlappung zwischen Endothelzellen Zelltypspezifische Marker und DE-Gene, die in mit AAV-VEGF behandelten Augen identifiziert wurden (ergänzende Abbildung 7a).

Endothelzellspezifische Markergene werden durch VEGF und T-Zell-spezifische Gene durch TNF-α hochreguliert. (a) Die VEGF-Expression induzierte eine Hochregulierung endothelialer und perivaskulärer zellspezifischer Markergene im Netzhautgewebe. Sowohl die TNF-α- als auch die IL-6-Expression induzierte eine Anreicherung von Makrophagen-/Monozyten-spezifischen Genen. Nur TNF-α induzierte eine signifikante Hochregulierung von B- und T-Zell-spezifischen Genen in der Netzhaut. (b) Die Heatmap von T-Zell-spezifischen Genen, die bei jeder Behandlung signifikant dereguliert wurden, zeigte eine starke Hochregulierung dieser Gene durch AAV-TNF-α. (c) Immunfluoreszenzfärbung mit dem Pan-T-Zellmarker CD3 zeigte eine T-Zell-Infiltration in AAV-TNF-α-injizierten Augen (grün = CD3, blau = DAPI). Beachten Sie die erhöhte Netzhautdicke und die Desorganisation der Netzhautschichten bei mit AAV-TNF-α behandelten Augen.

Expressionsänderungen der identifizierten relevanten zelltypspezifischen Markergene (vaskuläre Endothelzellen, Monozyten) waren größtenteils positiv (ergänzende Abbildung 7b, c), was auf einen allgemeinen Anstieg dieser Zelltypen bei der jeweiligen AAV-Behandlung schließen lässt. Unsere Anreicherungsanalyse zeigte außerdem die stärkste Hochregulierung von T-Zell-spezifischen Markergenen in TNF-α-Retinae (Abb. 6a, b). Wir gingen dieser Beobachtung durch eine histologische Analyse der Netzhautquerschnitte nach und bestätigten tatsächlich, dass Zellen, die den Pan-T-Zellmarker CD3 exprimierten, in Augen mit AAV-TNF-α-Injektion vorhanden waren (Abb. 6c), was darauf hindeutet, dass T-Zellen vorhanden sind Die Infiltration wird durch AAV-TNF-α induziert.

Ein häufig verwendetes Tiermodell für proliferative Retinopathien ist das Modell der sauerstoffinduzierten Retinopathie (OIR), das sowohl Neovaskularisation als auch Neurodegeneration aufweist. Neugeborene Mäuse werden vom 7. bis 12. postnatalen Tag 75 % Sauerstoff ausgesetzt und kehren danach bis zum 17. Tag zur Raumluft (21 % Sauerstoff) zurück. Am 7. Tag ist das Netzhautgefäßsystem der Mäusewelpen noch unreif und anfällig für Bedingungen mit hohem Sauerstoffgehalt. Der Verlust von Kapillaren in der Mitte der Netzhaut führt zur Bildung eines avaskulären Bereichs. Bei der Rückkehr zur Raumluft am Tag 12 wird der Bereich hypoxisch und die Hif1α-abhängige VEGF-Expression löst nachweislich die Angiogenese aus und erreicht ihren Höhepunkt bei P1711,12. Aufgrund der Hypoxie wird in diesem Modell auch eine Apoptose von Neuronen und eine Ausdünnung der Netzhaut im avaskulären Bereich beobachtet58. Um die durch AAV-VEGF, TNF-α und IL-6 induzierten Transkriptomveränderungen besser zu verstehen, wollten wir das Transkriptom von AAV-transduzierten Netzhäuten mit OIR-Netzhäuten vergleichen. Zunächst untersuchten wir die im OIR-Modell induzierten Transkriptomveränderungen im Vergleich zu Kontrollen am 12. postnatalen Tag (P12), P13, P14, P15 und P16. PCA zeigte eine klare Trennung zwischen dem OIR-Modell und den Kontrollen (Abb. 7a). Bemerkenswerterweise waren im PCA auch zeitabhängige Veränderungen im Transkriptom von Kontroll- und OIR-Mäusen deutlich sichtbar (Abb. 7a). Die größte Anzahl signifikant unterschiedlich exprimierter Gene (BH-angepasster p-Wert <0, 05) wurde bei P12 (10.855) nachgewiesen, kurz nachdem die Mäuse aus der hyperoxischen Kammer entfernt wurden (Ergänzungstabelle S2). Zu späteren Zeitpunkten verringerte sich die Anzahl der unterschiedlich exprimierten Gene zwischen P13 und P16 auf etwa 3000–7000 Gene (Abb. 7b), was auf eine vorübergehende Reaktion direkt nach dem Ende der hyperoxischen Behandlung hindeutet (P12). Wie erwartet nahm ab P13 zu Beginn der Hypoxie im avaskulären Bereich die endogene Expression des Hif1a-abhängigen Faktors Maus-Vegf mit der Zeit allmählich zu (ergänzende Abbildung 8a), ähnlich wie in früheren Studien . Die Il6-Expression wurde nicht nachgewiesen, während die TNF-α-Expression bei P13 und 14 ihren Höhepunkt erreichte (ergänzende Abbildung 8b), was auf eine frühe Entzündungskomponente im OIR-Modell schließen lässt.

Die transkriptomische Signatur der AAV-VEGF-Behandlung ist der bei P16-OIR-Mäusen beobachteten am ähnlichsten. (a) PCA zeigte eine klare Trennung der Proben nach Behandlung (Normoxie vs. Hypoxie) und Zeitpunkt. (b) Die größte Anzahl an Genexpressionsänderungen wurde bei P12 und P13 beobachtet und die Anzahl der unterschiedlich regulierten Gene stabilisierte sich bei 3000–5000 Genen bei P14–P16. (c) Die stärkste Anreicherung für ähnliche Genexpressionsmuster wurde zwischen OIR P16 und AAV-VEGF beobachtet (2,2-fache Anreicherung). (d) Überlappungen zwischen DE-Genen von AAV-VEGF, AAV-TNF-α, AAV-IL6 und dem OIR-Modell (P16) sind im Venn-Diagramm dargestellt. (e) Gene, die spezifisch von Endothelzellen exprimiert werden, waren in Augen, denen AAV-VEGF injiziert wurde, und in der P15/P16-OIR-Retina hochreguliert, nicht jedoch in der P12/P13-OIR-Retina.

Beim Vergleich der drei AAV- und OIR-Mausmodelle beobachteten wir eine signifikante Überlappung unterschiedlich exprimierter Gene (Hypergeometrischer Test, BH-angepasster p-Wert <0,01) in der OIR-Retina im Vergleich zu denen, die im AAV-VEGF-Modell identifiziert wurden (Abb. 7c, D). Die größte Anreicherung von DE-Genen wurde zwischen AAV-VEGF-Mäusen und dem OIR-Modell bei P16 gefunden, dem Spitzenzeitpunkt des vaskulären Phänotyps im OIR-Modell. Die Integration der zuvor beschriebenen Einzelzelldatensätze 48, 54 zeigte, dass im OIR-Datensatz (ergänzende Abbildung 8c) unter anderem auch gefäßzellspezifische Markergene angereichert waren, ähnlich wie in den AAV-VEGF-Daten. Bemerkenswerterweise wurde die Mehrzahl der endothelzellspezifischen Gene zu frühen OIR-Zeitpunkten zunächst herunterreguliert und dann ab P15 hochreguliert, ähnlich wie bei AAV-VEGF (Abb. 7e). Im Gegensatz dazu überlappten DE-Gene, die aus dem OIR-Mausmodell im Spätstadium identifiziert wurden, nicht jedoch die aus AAV-VEGF identifizierten, signifikant mit Genen, die spezifisch in bipolaren Zellen exprimiert wurden. Wir kamen zu dem Schluss, dass die perivaskulären und vaskulären Endothelzelltypen von der AAV-VEGF-Behandlung betroffen sind (Abb. 6a) und dass im OIR-Modell aufgrund der in diesem Modell induzierten Unterernährung und Ischämie weitere Zelltypen betroffen sind.

Schließlich wollten wir verstehen, welche Signalwege in den AAV-VEGF-gesteuerten Retinopathiemodellen im Vergleich zum OIR-Modell betroffen waren (ergänzende Abbildung 8d). Interessanterweise wurden mehrere Wege im Zusammenhang mit der extrazellulären Matrix in DE-Genen angereichert, die entweder aus dem AAV-VEGF- oder dem OIR-Modell identifiziert wurden, was auf ähnliche Veränderungen in beiden Modellen schließen lässt. Wieder einmal erwies sich die „Extrazelluläre Matrix-Organisation“ als einer der am stärksten deregulierten Signalwege sowohl bei AAV-VEGF als auch bei OIR P16. Interessanterweise wurden unter den OIR-spezifischen Signalwegen neuronale signalbezogene Gene angereichert, während zu den AAV-VEGF-spezifischen Signalwegen Signalwege gehörten, die an Zelloberflächeninteraktionen beteiligt sind. Insgesamt ergab unsere Analyse Ähnlichkeiten, aber auch Unterschiede zwischen den vier verschiedenen Mausmodellen für Retinopathien und ist somit eine wertvolle Ressource für Forscher, um das am besten geeignete Tiermodell im Hinblick auf ihr präklinisches Forschungsthema zu identifizieren.

In dieser Studie haben wir durch AAV-VEGF, AAV-TNF-α und AAV-IL-6 induzierte Transkriptomveränderungen gemessen und diese Expressionsänderungen miteinander und mit Genexpressionsänderungen verglichen, die im etablierten OIR-Modell beobachtet wurden. Unser Ziel war es, die potenziellen molekularen Mechanismen, die zu Netzhautpathologien beitragen, besser zu verstehen, aber auch unsere Fähigkeit zu verbessern, die geeigneten Tiermodelle für jede Pathologie auszuwählen.

AAVs haben sich als nützliches Werkzeug zur schnellen Generierung neuartiger Tiermodelle erwiesen, die ein hohes Maß an Flexibilität hinsichtlich Timing und gewebespezifischer Expression ermöglichen. In unserer Studie haben wir das ShH10-Kapsid für die Expression der drei menschlichen Transgene ausgewählt. Selbst im globalen Maßstab, gemessen mit einer Hochdurchsatzmethode wie RNA-Seq, führte die Injektion des Kontrollkapsids (1 × 108 oder 1 × 109 VG/Auge) in Mäuseaugen mit einer biologisch inaktiven Sequenz zu einer sehr geringen Genexpression Änderungen. Die AAV-vermittelte Expression von hTNF-α, hIL-6 oder hVEGF führte zu einer hohen Expression dieser menschlichen Transgene, was wiederum zu starken und deutlichen Transkriptomveränderungen führte. Obwohl Messfehler in der RNA-Seq, die durch das gleichzeitige Vorhandensein von menschlichen und murinen Versionen des AAV-exprimierten Transgens verursacht werden, theoretisch möglich sind, erwarten wir keine große Fehlquantifizierung, da menschliche Transgene codonoptimiert sind und über einen V5-Tag verfügen, was sie auch bedeutet hinreichend unähnlich zu ihrer endogenen Transkriptsequenz. Darüber hinaus konnten wir in Gegenwart von AAV-exprimierten Transgenen keine Verringerung des Prozentsatzes eindeutig kartierter Lesevorgänge beobachten (Daten nicht gezeigt).

Laut der vorliegenden Literatur infiziert ShH10 hauptsächlich Müller-Gliazellen55, die mit ihren Fortsätzen anatomisch die gesamte Netzhaut durchziehen und so die Sekretion von VEGF, TNF-α und IL-6 in der gesamten Netzhaut ermöglichen. Die RNAscope-Analyse zeigte die Expression menschlicher Transgene innerhalb der RGC-Schicht und der inneren Kernschicht, die möglicherweise von Müller-Glia stammen. Darüber hinaus zeigte die RNAscope-Analyse eine starke Expression aller drei Transgene im Ziliarkörper, was erklärt, warum in der RNA-Seq-Analyse des präparierten Augenmuschelgewebes einschließlich des Ziliarkörpers hohe Expressionsniveaus der Transgene festgestellt wurden. Die starke Expression menschlicher Transgene im Ziliarkörper könnte auch das Wachstum von Endothelgewebe um den Ziliarkörper in den peripheren Netzhautbereichen in Augen, denen AAV-VEGF injiziert wurde, erklären19. Interessanterweise führte die IVT-Injektion von ShH10-GFP in der Originalarbeit, die das ShH10-Kapsid beschreibt, zu einer starken GFP-Expression in der Müller-Glia sowie im Ziliarkörper, dieser Befund wurde jedoch nicht weiter diskutiert55. In der Zwischenzeit haben andere Forscher AAV-Kapside mit guter Transduktionseffizienz des Ziliarkörpers zur Behandlung von Glaukom untersucht und festgestellt, dass das ShH10-Kapsid im Vergleich zu den Kapsiden AAV1, AAV2, AA5 und AAV6 am besten für die Transduktion des Ziliarkörpers geeignet ist60. Während die Transduktion des Ziliarkörpers für bestimmte Anwendungen wünschenswert sein kann, kann eine streng zelltypspezifische Expression erforderlich sein, z. B. für gentherapeutische Ansätze zur Abgabe intrazellulärer Proteine. Für sekretierte Faktoren wie VEGF, TNF-α und IL-6 ist eine zelltypspezifische Expression möglicherweise nicht erforderlich. Allerdings wird es auch in Zukunft interessant sein, andere Kapside auf die Expression von VEGF, TNF-α und IL-6 in der Netzhaut zu testen und die durch verschiedene Zelltropismen erzielten Phänotypen zu vergleichen. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass für jede Anwendung eine sorgfältige Auswahl des Kapsids erfolgen sollte.

In unserer Analyse wurden signifikant verändernde Gene in der Komplementkaskade in Augen, denen AAV-TNF-α injiziert wurde, stark und spezifisch hochreguliert. Unter ihnen war der Komplementwegfaktor C3 eines der am stärksten hochregulierten Gene in Augen, denen AAV-TNF-α injiziert wurde. C3 spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung des klassischen und alternativen Komplementwegs und Mutationen in C3 und anderen Mitgliedern der Komplementkaskade korrelieren mit einem höheren Risiko für AMD61,62,63 und Uveitis64. Darüber hinaus ist bekannt, dass C3 in der Netzhaut von AMD-Patienten65,66 sowie im Glaskörper, im Kammerwasser und im Serum von Uveitis-Patienten67,68,69 hochreguliert ist, sodass die gezielte Behandlung des Komplementsystems einen attraktiven Ansatz zur Behandlung von Retinopathien darstellt70. Dementsprechend werden Anti-C3- und Anti-C5-Behandlungen derzeit in klinischen Studien im Spätstadium bei geografischer Atrophie (GA) als Folge einer AMD71,72 evaluiert. In der Vergangenheit haben sich transgene Tiere, die die Expression von Komplementgenen verändern, oder Mäuse, die menschliche Varianten komplementbezogener Gene exprimieren, als äußerst nützlich erwiesen, um ihren Beitrag zum Fortschreiten der Krankheit zu verstehen65,73,74,75,76,77,78. Um neuartige und wirksame Therapien weiterzuentwickeln, sind Tiermodelle mit robuster Aktivierung des Komplementwegs erforderlich. Im LPS-induzierten Uveitis-Modell sind komplementbezogene Gene, einschließlich C3, hochreguliert39, was auf eine Komplementaktivierung hindeutet. In ähnlicher Weise führt die experimentelle Autoimmun-Uveitis (EAU) zur Aktivierung des Komplementsystems und eine Blockade des Komplementsystems lindert die Krankheitspathologie79. Die Aktivierung des Komplementsystems ist auch im Modell der laserinduzierten choroidalen Neovaskularisation (CNV) sichtbar, und die Hemmung verschiedener Komplementfaktoren hatte positive Auswirkungen80,81,82. Allerdings sind sowohl die experimentellen Uveitis-Modelle als auch das Laser-CNV-Modell vorübergehend und ermöglichen nur kurzfristige Untersuchungen. Im Gegensatz dazu zeigte C3 im vorgestellten AAV-TNF-α-Modell drei und sechs Wochen nach der IVT-Injektion von AAV-TNF-α eine starke und anhaltende Hochregulierung, was Langzeitstudien des Komplementsystems ermöglichte. Darüber hinaus haben wir als Beweis des Mechanismus gezeigt, dass die Behandlung mit dem neutralisierenden TNF-α-Antikörper Golimumab die C3-Expression reduziert, was zeigt, dass die Komplementaktivierung in unserem Modell reversibel ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das AAV-TNF-α-induzierte Mausmodell ein wertvolles Instrument zur Untersuchung der Rolle des Komplementsystems beim Fortschreiten der Krankheit darstellt und eine langfristige TNF-α- und C3-Expression aufweist, die mit der menschlichen Pathologie vergleichbar ist, die sich über Jahrzehnte entwickelt .

Zusätzlich zu C3 waren zelluläre Adhäsionsmoleküle (CAMs) wie Icam1, Vcam1 und Madcam1 in Augen, denen AAV-TNF-α injiziert wurde, stark hochreguliert, was die frühere Beobachtung einer Immunzellinfiltration und Vaskulitis in Augen, denen AAV-TNF-α injiziert wurde, untermauert Histologie19. MAdCAM-1 wird durch TNF-α in verschiedenen Endothelzellen induziert und rekrutiert T-Zellen in entzündeten Geweben83,84,85 und wurde daher kürzlich als interessantes Ziel zur Behandlung entzündlicher Darmerkrankungen identifiziert86. Zusätzlich zur Madcam1-Hochregulierung beobachteten wir in unserem AAV-TNF-α-gesteuerten Uveitis-ähnlichen Modell eine T-Zell-Infiltration, was mit der gut beschriebenen Rolle von T-Zellen bei Uveitis-Patienten und Uveitis-Nagetiermodellen übereinstimmt87,88. Obwohl allgemeines Interesse an der Rolle von TNF-α und CAMs im Zusammenhang mit Retinopathien besteht, gibt es unseres Wissens nur eine aktuelle Studie von Peng et al. Dies zeigt eine direkte Funktion von murinem Madcam1 bei der Netzhautdegeneration83. In Übereinstimmung mit Peng et al. zeigten wir eine Hochregulierung von Madcam1 in Augen, denen AAV-TNF-α injiziert wurde, was mit einer Invasion von T-Zellen korreliert. Aufbauend auf dieser Beobachtung haben wir gezeigt, dass MAdCAM-1 auch in TNF-α-stimulierten HRMECs hochreguliert ist, was darauf hindeutet, dass die TNF-α-induzierte Regulierung von MAdCAM-1 auch in menschlichen Netzhautzellen relevant sein könnte.

Um die Unterschiede zwischen verschiedenen Retinopathie-Erkrankungsmodellen besser zu verstehen, verglichen wir Genexpressionsprofile der generierten AAV-gesteuerten Retinopathiemodelle mit RNASeq-Daten des häufig verwendeten OIR-Modells11,12. Um die im OIR-Modell vorhandene vorübergehende Expressionsdynamik zu erfassen, haben wir Mausaugen zu fünf aufeinanderfolgenden Zeitpunkten nach der hyperoxischen Behandlung gesammelt. Tatsächlich haben andere Autoren eine Analyse der OIR-Genexpression durchgeführt. Viele Studien stützten sich jedoch auf Microarray-Daten, die nur einen Teil des Transkriptoms bewerteten, im Gegensatz zur hier vorgestellten gesamten Transkriptomanalyse. Andererseits umfassten OIR-RNA-Seq-Studien im Vergleich zu unserer Studie, in der wir detailliertere Einblicke in zeitabhängige Genexpressionsänderungen liefern, eine weniger dichte Stichprobe von Zeitpunkten. Die Studie von Yang et al.46 konzentrierte sich auf Veränderungen der Genexpression während und kurz nach einer hyperoxischen Behandlung, während unsere Studie hauptsächlich an Veränderungen der Genexpression nach der Rückkehr zu normoxischen Bedingungen und einem detaillierten Vergleich mit AAV-induzierten Veränderungen der Genexpression interessiert war. Dennoch beobachteten wir in den beiden Studien gemeinsame Genexpressionssignaturen von Schlüsselgenen, beispielsweise waren VEGF und Edn2-Gen beide bei P13 hochreguliert.

Es ist bekannt, dass VEGF ein wichtiger Treiber des OIR-Modells ist und eine Anti-VEGF-Behandlung die Neovaskularisation im OIR-Modell verhindert17,24. Somit zeigten die DE-Gene im AAV-VEGF-Modell erwartungsgemäß die größte Überlappung mit denen, die im OIR-Modell identifiziert wurden. Durch die Integration von Einzelzell-RNA-Seq-Expressionsdaten haben wir gezeigt, dass innerhalb des für das OIR-Modell gemessenen Zeitverlaufs endothelzellspezifische Gene ab P15 zunächst herunterreguliert und dann hochreguliert wurden. Auch andere Studien haben eine Herunterregulierung von Angiogenese-bezogenen Genen wie CD34 im OIR-Modell bei P12 festgestellt, während endothelzellspezifische Gene wie Esm1 oder Edn2 bei P1789 hochreguliert waren. Esm1 ist ein bekanntes Gen, das durch VEGF in Spitzenzellen induziert wird und eine entscheidende Rolle bei der Angiogenese spielt. Seine Blockierung hemmt die Neovaskularisation verschiedener Nagetiermodelle der Neovaskularisation, einschließlich OIR, Laser-CNV und der transgenen Rho/VEGF-Maus90,91. Dementsprechend beobachteten wir auch eine Hochregulierung des Esm1-Gens sowohl im OIR-Datensatz als auch im AAV-VEGF-gesteuerten Modell, was sehr gut dem beobachteten Neovaskularisationsphänotyp ähnelt. Da wir im OIR-Modell eine hohe zeitliche Auflösung der Genexpressionsänderungen liefern, konnten wir den Wechsel zwischen der Herunter- und Hochregulierung endothelzellspezifischer Gene auf P14 genau bestimmen. Diese Genexpressionsveränderungen passen sehr gut zu den phänotypischen Veränderungen im OIR-Modell, wo bei P12 die Entwicklung des Gefäßsystems beeinträchtigt ist und avaskuläre Bereiche vorhanden sind und später die Neovaskularisierung ihren Höhepunkt bei etwa P1792,93 erreicht.

Obwohl viele Signalwege, einschließlich ECM-bezogener Signalwege und endothelzellspezifischer Reaktionen, zwischen dem OIR-Modell und den mit AAV-VEGF behandelten Mäusen ähnlich waren, beobachteten wir auch Unterschiede zwischen diesen Krankheitsmodellen: Beispielsweise beobachteten wir im OIR-Modell, aber nicht bei AAV-VEGF, neuronale Signalwege und Synapsen-bezogene Gene wurden für DE-Gene signifikant angereichert. Im Einklang mit dieser Beobachtung beobachteten wir eine signifikante Überlappung neuronaler zellspezifischer Gene (z. B. Bipolarzellen, RGCs) und DE-Genen, die im OIR-Modell identifiziert wurden. Für das OIR-Modell werden Jungtiere im Alter von P12 bis P17 verwendet, ein Zeitpunkt, der einem Zeitpunkt entspricht, an dem sich noch vaskuläre und neuronale Netzwerke in der Netzhaut der Maus entwickeln94,95. Darüber hinaus wurden im OIR-Modell neuronaler Tod und eine verminderte Netzhautfunktion beobachtet96,97, wahrscheinlich aufgrund von Ischämie und Unterernährung, die durch Hypoxie hervorgerufen wurden. Dementsprechend wurde das OIR-Modell als das geeignetere Modell für die Frühgeborenen-Retinopathie (ROP)93 diskutiert, eine Krankheit, die Frühgeborene betrifft. Während für das OIR-Modell sehr junge Mäusewelpen benötigt werden, können alte oder diabetische Mäuse mit der AAV-Überexpression menschlicher Transgene kombiniert werden, um altersbedingte oder Diabetes-assoziierte menschliche Retinopathien wie AMD oder DR in Zukunft besser abzubilden.

Trotz unserer Bemühungen, ein optimales experimentelles Design sicherzustellen, gelten bestimmte Einschränkungen, vor allem die Tatsache, dass AAV- und OIR-Sequenzierungsdatensätze in unabhängigen Experimenten generiert wurden. Darüber hinaus unterscheiden sich die Modelle auch aus biologischer Sicht, da das OIR-Modell im Gegensatz zu unseren AAV-induzierten Modellen, die mit erwachsenen Mäusen entwickelt wurden, während der Entwicklung sehr junge Mäusewelpen verwendet. Während in der OIR-Studie zu jedem Zeitpunkt 3 oder 4 Proben einbezogen wurden, wurde die AAV-Studie mit 5 oder 6 Replikaten pro Gruppe durchgeführt. Darüber hinaus war die Vorbereitung und Sequenzierung der Bibliothek von unterschiedlichen Protokollen abhängig. Um diese Einschränkungen zu mildern, basiert unsere Analyse auf relativen Faltungsänderungen zwischen der Behandlung und den jeweiligen Kontrollen und nicht auf absoluten Expressionswerten, wodurch Unterschiede bei der Bibliotheksvorbereitung berücksichtigt werden.

Insgesamt haben wir hier die Genexpressionsprofile von AAV-VEGF-, TNF-α- oder IL-6-gesteuerten Retinopathie-Mausmodellen charakterisiert und diese Messungen mit öffentlich verfügbaren Einzelzell-RNA-Expressionsdaten kombiniert. Unsere Studie liefert einzigartige Einblicke in die molekularen und zellspezifischen Veränderungen, die zu Netzhauterkrankungen führen. Dadurch werden neue potenzielle Behandlungsmöglichkeiten für Netzhauterkrankungen aufgedeckt und gleichzeitig die Möglichkeit geboten, diese in einem stabilen Krankheitsmodell zu testen, das mit der menschlichen Pathologie vergleichbar ist. Durch die weitere Messung von Genexpressionsänderungen im etablierten OIR-Modell haben wir neue und etablierte Tiermodelle für Retinopathien verglichen und Forschern wichtige Informationen zur Verfügung gestellt, die sie bei der Entscheidung unterstützen, welches Tiermodell den Anforderungen eines bestimmten präklinischen Forschungsprojekts am besten entspricht.

C57BL/6 J-Mäuse wurden von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) gekauft. Für die AAV-Studie wurden 6–8 Wochen alte männliche Mäuse verwendet. Für die OIR-Studie wurden trächtige Weibchen gekauft und für die OIR-Experimente wurden männliche und weibliche Jungtiere bei P12 verwendet. Die Mäuse wurden in individuell belüfteten Käfigen in Gruppen von 2 bis 5 Personen bei konstanter Temperatur und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Mäuse hatten nach Belieben Zugang zu Standardfutter und Wasser für Nagetiere. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Tierschutzgesetz, den Richtlinien der Federation of the European Laboratory Animal Science Association (FELASA) und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt und von der für Tierschutz zuständigen Behörde des Landes Baden geprüft und genehmigt Württemberg (Regierungspräsidium Tübingen, Deutschland).

Zuvor wurden Plasmide mit dem allgegenwärtigen CAG-Promotor generiert, die für drei menschliche, codonoptimierte Transgene (VEGF-A 165, TNF-α und IL-6) kodieren, die eine V5-Tag-Sequenz am 3'-Ende des Gens aufweisen19 Das AAV-Stuffer-Kontrollkonstrukt enthält eine nichtkodierende Sequenz aus der 3'-UTR des UBE3A-Gens und wurde an anderer Stelle beschrieben (Strobel 2015). Die in dieser Studie verwendeten AAVs wurden in das ShH10-Kapsid verpackt (Klimczak 2009). Die AAV-Produktion und Quantifizierung durch quantitative PCR erfolgte gemäß zuvor veröffentlichten Protokollen (Strobel 2019). Die folgenden für menschliche Codons optimierten Sequenzen waren in jedem der rekombinanten AAVs enthalten:

AAV-hIL6 –.

AAV-hTNFa –.

AAV-hVEGF –.

Den Mäusen wurden die verschiedenen AAVs unter Isoflurananästhesie intravitreal injiziert und nach der Anwendung von Augentropfen zur Lokalanästhesie (Novesin, OmniVision). Beiden Augen von 6 Mäusen pro Gruppe wurden entweder 1 × 108 virale Genome (VG)/Auge (niedrige Dosis) oder 1 × 109 VG/Auge (hohe Dosis) in 1 µL AAV-Puffer injiziert. Beachten Sie, dass AAV-VEGF in einer Konzentration von 1 × 108 VG/Auge und AAV-TNF-α und AAV-IL-6 in einer Konzentration von 1 × 109 VG/Auge mit passenden AAV-Stuffer-Kontrollen injiziert wurde. In einer unabhängigen Mäusekohorte wurde den Augen 2 Wochen nach der AAV-TNF-α-Behandlung 1 µL Vehikel oder neutralisierendes Anti-TNF-α-Golimumab (100 mg/ml, Simponi, 4.223.913, Komtur Apotheke) IVT injiziert. Wenn die IVT-Injektion fehlschlug (z. B. aufgrund einer Schädigung eines großen Blutgefäßes oder der Linse), wurde das Auge von der Analyse ausgeschlossen.

Die In-vivo-Bildgebung erfolgte wie zuvor beschrieben19. Kurz gesagt, Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion mit 60–90 mg/kg Ketamin (Medistar) und 6–8 mg/kg Xylazin (Rompun, Bayer) anästhesiert. Die Schüler wurden mit 5 mg/ml Tropicamid (Mydrum, Bausch + Lomb) und Phenylephrin (Neosynephrin-POS 10 %, Ursapharm) erweitert. Für die Aufnahme von Bildern der optischen Kohärenztomographie (OCT) und Autofluoreszenzbildern (AF) wurde ein Spectralis HRA/OCT-Gerät (Heidelberg Engineering) verwendet, das mit einem 55°-Weitfeldobjektiv ausgestattet ist. Für die Fundus-Fluorescein-Angiographie (FFA) wurden 200 µL einer 0,2 %igen Fluorescein-Lösung (Alcon) subkutan injiziert und 90 s nach der Injektion mit dem Spectralis HRA/OCT (Heidelberg Engineering) aufgezeichnet. Mäuse wurden durch Genickbruch eingeschläfert. Die Netzhaut und die Augenmuschel (einschließlich RPE, Aderhaut, Sklera und Ziliarkörper) wurden präpariert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Die OIR-Experimente wurden gemäß zuvor veröffentlichten Protokollen durchgeführt (Smith et al.11). Kurz gesagt, 7 Tage alte männliche und weibliche Jungtiere wurden mit ihren Müttern in eine hyperoxische Kammer (75 % Sauerstoff) überführt. Bei P12 wurde die Sauerstoffkonzentration innerhalb von etwa 3 Stunden langsam wieder auf normoxische Bedingungen (21 % Sauerstoff) reduziert. Kontrollmäuse blieben während des gesamten Experiments unter normoxischen Bedingungen. Mäuse wurden bei P12, P13, P14, P15 und P16 durch Zervixluxation eingeschläfert. Die präparierten Netzhäute wurden in RNAlater (Invitrogen) aufbewahrt.

Schockgefrorenes präpariertes Netzhaut- und Augenmuschelgewebe (n = 72) wurde in 700 µL Qiazol (Qiagen) unter Verwendung eines Precellys Evolution-Homogenisators (Bertin Technologies) homogenisiert. Netzhautproben wurden mit Keramikperlen (MPbio, 6913-500) und Augenmuschelproben mit Metallperlen (Bertin Technologies, 15.987.602) homogenisiert und in 4 separaten Chargen verarbeitet. Die Gesamt-RNA wurde mit dem miRNeasy Micro Kit (Qiagen, 217.084) gemäß dem Gewebeprotokoll des Herstellers einschließlich DNase-Behandlung auf der Säule (Qiagen, 79.254) extrahiert. Gesamt-RNA-Proben (36 Augenmuscheln, 36 Netzhautproben) wurden quantitativ und qualitativ mit dem fluoreszenzbasierten Broad Range Quant-iT RNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) und dem Standard Sensitivity RNA Analysis DNF-471 Kit auf einem 96-Kanal-Fragment bewertet Analysator (Agilent) bzw. Die Konzentrationen lagen im Durchschnitt bei 48,7 ng/µL, während der RIN zwischen 5,2 und 9,6 lag, mit einem Median von 9,2. Zwei Proben mit einem RIN unter 6 wurden von der Weiterverarbeitung ausgeschlossen: AAV-Stuffer (hoch) Augenmuschel-Replikat 4 und AAV-VEGF-Augenmuschel-Replikat 5. Eine Zusammenfassung aller Proben in der AAV-Studie finden Sie in Tabelle 1.

Retinae wurden von 12 bis 16 Tage postnatalen C57BL/6 J-Mäusen präpariert (n = 32). RNAlater-konservierte Gewebe wurden aufgeschlossen und in CK14-Röhrchen (VWR, 10144-496) mit RLT-Puffer unter Verwendung eines Precellys Evolution-Homogenisators (Bertin Technologies) homogenisiert. Die Gesamt-RNA wurde dann mit dem MagMAX-96-Gesamt-RNA-Isolierungskit (Thermo Fisher Scientific, AM1830) extrahiert, einschließlich eines DNase-Verdaus vor der endgültigen Elution (Qiagen, 79254). Gesamt-RNA-Proben wurden quantitativ und qualitativ auf einem Synergy-Mikroplattenlesegerät mit einem Gen5-Take3-Modul (BioTek) bzw. dem Eukaryote-Gesamt-RNA-6000-Nano-Mikrofluidikchip (Agilent, 5067-1511) auf einem 2100-Bioanalyzer-System (Agilent) bewertet. Die Konzentrationen lagen im Durchschnitt bei 136,3 ng/µL, während der RIN ausgewählter Proben über 8,4 lag. Alle Proben wurden zur Bibliotheksvorbereitung weiterverarbeitet. In Tabelle 2 finden Sie eine Zusammenfassung aller Proben in der OIR-Studie.

70 aus der Netzhaut und der Augenmuschel stammende RNA-Proben wurden auf der automatisierten Flüssigkeitsplattform MicroLab STAR (Hamilton) normalisiert. Für den Bibliotheksaufbau wurde eine Gesamt-RNA-Eingabe von 250 ng mit dem NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit für Illumina #E7760 zusammen mit dem vorgeschalteten NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module #E7490 und den NEBNext Multiplex Oligos für Illumina #E7600 verwendet stromabwärts (alle New England Biolabs). Die einzige Abweichung vom Protokoll des Herstellers war die Verwendung von Ampure XP-Beads (Beckman Coulter) für die doppelsträngige cDNA-Reinigung anstelle der empfohlenen SPRIselect-Beads. Die Index-PCR wurde mit 12 Zyklen durchgeführt, während die endgültige Bibliothek in 35 µL eluiert wurde. mRNA-Bibliotheken wurden dann mit dem High Sensitivity dsDNA Quanti-iT Assay Kit (ThermoFisher) auf einem Synergy HTX (BioTek) quantifiziert. Die Molarität der Bibliothek lag im Durchschnitt bei 149 nM. mRNA-Bibliotheken wurden außerdem mit dem High Sensitivity Small Fragment DNF-477 Kit auf einem 96-Kanal-Fragmentanalysator (Agilent) auf Größenverteilung (Abstrichanalyse mit durchschnittlich 360 bp) und Vorhandensein von Adapterdimeren (< 0,5 %) untersucht. Alle 70 Sequenzierungsbibliotheken wurden dann auf dem MicroLab STAR (Hamilton) normalisiert, gepoolt und mit PhiX Control v3 (Illumina) versetzt. Der Bibliothekspool wurde anschließend auf einer S4-Durchflusszelle geclustert und auf einem NovaSeq 6000-Sequenzierungssystem (Illumina) mit Dual-Index, Paired-End-Reads bei 2 × 100 bp Länge sequenziert (Leseparameter: Rd1: 101, Rd2: 8, Rd3: 8, Rd4: 101) und erreicht eine durchschnittliche Tiefe von 31,3 Millionen Pass-Filter-Lesevorgängen pro Probe (7,0 % CV). Die Beschreibung der Vorbereitung und Sequenzierung der RNA-Bibliothek stimmt weitgehend mit der von Becker et al.36 gegebenen überein.

Nach Angaben des Herstellers wurde eine Gesamt-RNA-Eingabe von 100 ng für den Bibliotheksaufbau mit dem TruSeq Stranded mRNA LT-Kit – Set A (Illumina, RS-122-2101) zusammen mit der SuperScript II Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, 18064014) verwendet Protokoll. Die Qualität der mRNA-Bibliotheken wurde auf das Vorhandensein von Adaptern und Heterodimeren mithilfe des Mikrofluidik-Chips DNA 1000 (Agilent, 5067-1504) beurteilt, während die Molarität der Bibliotheken mithilfe des Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, P11496) gemessen wurde. Alle 32 Sequenzierungsbibliotheken wurden dann normalisiert, gepoolt und mit PhiX Control v3 (Illumina) versetzt. Der Bibliothekspool wurde anschließend mit dem TruSeq SR Cluster Kit v3 (Illumina, GD-401-3001) geclustert und mit TruSeq SBS Kit v3-Reagenzien (Illumina, FC-401-3002) auf einem HiSeq 2000 Sequencing System (Illumina) sequenziert Einzelindex, Single-Read-Reads mit einer Länge von 1 × 51 bp (Read-Parameter: Rd1: 52, Rd2: 7) und erreichen eine durchschnittliche Tiefe von 24,9 Millionen Pass-Filter-Reads pro Probe (13,1 % CV).

Primäre humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Netzhaut (HRMEC, ACBRI 181, Cell Systems Corporation) wurden in Endothelzellwachstumsmedium (C-22010, Promocell) auf mit 0,1 % Gelatine vorbeschichteten Platten (ES-006-B, Millipore) kultiviert. Die Zellen wurden in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Der LUNA-FL-Zellzähler (LogosBio) mit Acridinorange-Farbstoff (F23002, LogosBio) wurde zur Zellquantifizierung vor der Aussaat verwendet. HRMECs wurden mit 10 ng/ml rekombinantem humanem TNF-α (210-TA-005, RnD Systems) 24 Stunden lang bei 37 °C stimuliert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in RLT-Puffer von Qiagen lysiert und die RNA mit dem RNeasy Mini Kit (74106, Qiagen) gemäß dem Handbuch des Herstellers extrahiert.

Die cDNA-Synthese erfolgte mit dem Hochleistungs-cDNA-Kit (4368814, Applied Biosystems) und die qRT-PCR wurde mit dem Taqman Universal PCR Master Mix (4304437, Applied Biosystems) auf einem QuantStudio 6 Real-Time PCR-System (Applied Biosystems) durchgeführt. Die relative Expression (Fachinduktion) wurde unter Verwendung der ΔΔCT-Methode berechnet und die Gene 18S (für Mausgewebe) und POLR2A (für HRMECs) wurden als Normalisierungskontrollen verwendet. The following Taqman probes were used in this study: 18S (Hs99999901_s1), POLR2A (Hs00172187_m1), Madcam1 (Hs00369968_m1), CCL2 (Mm00441242_m1) and a custom-made Taqman probe detecting human codon-optimized VEGF with a V5 tag (fwd primer 5ʹ - ACTGAACGAGAGAACCTGCA -3ʹ, Rev-Primer 5ʹ GCCCAGCAGAGGATTAGGAA-3ʹ, Sonde 5ʹ- CTAGAAGAGGTGGCG-3ʹ).

Augen zur Validierung der C3-Expression wurden aus einer unabhängigen Mauskohorte generiert, die an anderer Stelle veröffentlicht wurde57. Kurz gesagt, 2 Wochen nach der IVT-Injektion von AAV-TNF-α wurden 100 µg Golimumab (Simponi) intravitreal injiziert. 6 Wochen nach der AAV-Injektion wurden ganze Augen entkernt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und in Lysepuffer (9803, Cell Signalling), ergänzt mit Proteinase-Inhibitor Pefabloc SC (76307-100MG, Sigma) mit Metallkügelchen (15987602, Bertin Technologies), homogenisiert. in einem Precellys Evolution Gewebehomogenisator (Bertin Technologies). Die C3-Expression wurde mit dem Mouse C3 SimpleStep ELISA Kit (ab26388, Abcam) gemäß dem Protokoll des Herstellers und mit einem SpectraMax Plus 384-Plattenlesegerät (Molecular Devices) gemessen.

Augen für die histologische Analyse wurden in einem unabhängigen Experiment erzeugt, das an anderer Stelle veröffentlicht wurde19. Die Augen wurden 3–6 Wochen nach der IVT-Injektion entkernt und direkt in 4 % Paraformaldehyd (AR1068, Boster) für 48 Stunden bei 4 °C fixiert. Die Augen wurden dehydriert, in Xylol inkubiert und unter Verwendung einer Gewebeverarbeitungsmaschine (Tissue-Tek VIP 6, Sakura) mit Paraffin infiltriert. Immunhistochemische Färbungen wurden an 3-µm-Schnitten mit dem Opal Multiplex IHC Kit (Akoya Biosciences) und auf der automatisierten Leica Bond-Plattform (Leica Biosystems, Melbourne, Australien) durchgeführt. Die Antigengewinnung erfolgte mit der BOND Epitope Retrieval Solution 1 (35608, Leica Biosystems, Melbourne, Australien) bei 95 °C und pH 6,0 für 20 Minuten. Polyklonaler Kaninchen-Anti-CD3-Antikörper (ab5690, Abcam) wurde 1:200 verdünnt und als Pan-T-Zell-Marker verwendet. Zur Entwicklung des Fluoreszenzsignals wurden OPAL-Polymer-Anti-Kaninchen-HRP-Sekundärantikörper (ARR1001KT, Akoya Biosciences) und OPAL 570-Reagenz (FP1488001KT, Akoya Biosciences) verwendet. Die Kerne wurden mit spektralem DAPI (FP1490, Akoya Biosciences) angefärbt und die Objektträger mit ProLong Antifade-Eindeckmedium (P36961, Invitrogen) montiert. Immunfluoreszenzfärbungen wurden mit einem Laser-Scanning-Mikroskop LSM700 (20 × Objektiv, Carl Zeiss Microscopy GmbH) abgebildet. RNAscope-In-situ-Hybridisierungen für humanes VEGF, TNF-α und IL-6 wurden extern bei ACDBio/Biotechne unter Verwendung des RNAscope 2.5 LSx Red-Assays durchgeführt. Auf der Grundlage der von jedem AAV exprimierten Codon-optimierten, V5-markierten menschlichen Transgene wurden maßgeschneiderte Sonden entwickelt. Als technische Kontrollen wurden die Sonden ACD Positive Control (Mm-Ppib, 313918, ACDBio) und ACD Negative Control (dapB, 312038, ACDBio) verwendet. Die Epitopgewinnung erfolgte 15 Minuten lang bei 88 °C und die Proteolyse wurde mit Protease III 15 Minuten lang bei 40 °C bei ACDBio durchgeführt. Die Objektträger wurden mit einem AxioScan.Z1-Objektträgerscanner (20-fach-Objektiv, Carl Zeiss Microscopy GmbH) abgebildet.

Im Falle des OIR-Datensatzes wurde GRCm38.96 als Referenzgenom verwendet. Für die AAV-Studie wurde ein individuelles Genom erstellt, indem codonoptimierte Sequenzen für hIL6, hTNFa und hVEGF in das Mausgenom eingefügt wurden. Die Generierung genomischer Indizes und das Lese-Alignment erfolgten über STAR (Version 2.5.2b). Die Quantifizierung auf Genebene wurde mit FeatureCounts (Version 1.5.1) und RSEM (Version 1.3.0) durchgeführt, wobei Multimapping-Lesevorgänge verworfen wurden. Qualitätskontrollmetriken wurden mit MultiQC (Version 1.0) ermittelt, wobei die Informationen unter anderem aus STAR, Picardmetrics (Version 0.2.4) und fastQC (Version 0.11.5) zusammengestellt wurden.

Gene mit einem Read-Count-Wert von unter 10 in allen Proben der AAV- oder OIR-Studie wurden aus unserer Analyse entfernt. Wir haben die Ausdruckswerte „counts“ mithilfe der von limma (Version 3.44.3) bereitgestellten Voom-Funktion normalisiert. In der AAV-Studie haben wir mithilfe der ComBat-Funktion (SVA-Paketversion 3.40.0) einen identifizierten Batch-Effekt im Zusammenhang mit dem RNA-Extraktionsbatch (Variable: rna_extraction_batch) korrigiert. Die Hauptkomponentenanalyse wurde mit dem pcaMethods R-Paket (Version 1.80.0) durchgeführt, wobei die 1000 variabelsten Gene ausgewählt wurden.

Die differenzielle Genexpression wurde mithilfe der lmFit-Funktion berechnet, die vom Limma R-Paket bereitgestellt wird. Signifikant verändernde Gene wurden basierend auf einem BH-bereinigten p-Wert < 0,05 ausgewählt. Pfadinformationen wurden mit dem Paket misgdbr R (Version 7.1.1) abgerufen. Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse wurde mit der Funktion „Überrepräsentationsanalyse“ (ORA) durchgeführt, die von Clusterprofiler Version 4.0.2 bereitgestellt wird. Direkte Vergleiche zwischen Gensätzen, die aus dem AAV-Experiment und der OIR-Studie abgeleitet wurden, wurden mithilfe eines hypergeometrischen Tests durchgeführt, der vom Stats R-Paket (Version 4.1.0) bereitgestellt wird. Venn-Diagramme wurden mit ggvenn (Version 0.1.9) erstellt.

Einzelzell-RNA-Seq-Datensätze wurden von GSE1352229, GSE130636 und GSE135922 erhalten. Bei Bedarf wurden menschliche Ensemble-IDs mithilfe des biomaRt R-Pakets (2.48.2) dem Maus-Homolog zugeordnet, wobei der Host-Parameter auf http://feb2021.archive.ensembl.org/ eingestellt war. Die Rohzählungen wurden mit dem Seurat R-Paket (Version 4.0.3) weiterverarbeitet. Über die FindMarkers-Funktion wurden zellspezifische Gene für jeden einzelnen Datensatz und Zelltyp identifiziert. Gene wurden als zellspezifisch definiert, wenn der BH-bereinigte p-Wert < 0,01 war und das Gen nicht als spezifisch für einen anderen Zelltyp identifiziert wurde (nur einzigartige Gene). Wie oben wurde die Überlappung zwischen zellspezifischen Markergenen und aus den AAV- oder OIR-Studien abgeleiteten Gensätzen durch den ORA-Funktionsteil von ClusterProfiler quantifiziert.

Alle Daten wurden in der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank hinterlegt und sind unter GSE200191 und GSE200195 verfügbar. Der für diese Studie verwendete Code ist unter https://github.com/bi-compbio/AAV_retinopathie_models verfügbar.

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Wir sind Manuel Deubler, Jürgen Haller, Jan Hering, Oliver Da Cruz Rodrigues Radmacher für die hervorragende technische Unterstützung bei allen AAV-in-vivo-Experimenten und Heike Bühler, Sabine Baierl und Martin Steiner für das OIR-Experiment sehr dankbar. Die Entwicklung von AAVs wurde von Benjamin Strobel und dem AAV-Labor von Boehringer Ingelheim unterstützt. Wir danken Daniel Gerlach für seine Hilfe bei der Erstellung der benutzerdefinierten Genomdateien für die AAV-Studie und Tanja Schönberger für die Unterstützung der histologischen Analyse. Wir danken Elke Markert und Thomas Ciossek für fruchtbare wissenschaftliche Diskussionen. Abbildung 1a wurde mit BioRender.com erstellt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Kolja Becker und Carina M. Weigelt.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Holger Klein und Norbert H. Redemann.

Global Computational Biology & Digital Sciences, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riß, Germany

Kolja Becker, Coralie Viollet, Werner Rust, Francesc Fernandez-Albert, Eric Simon & Holger Klein

Cardiometabolic Diseases Research, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riß, Germany

Carina M. Weigelt, Holger Fuchs, Nina Zippel, Remko A. Bakker & Norbert H. Redemann

Drug Discovery Sciences, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riß, Germany

Hannah Wyatt und Thorsten Lamla

Clinical Development & Operations Corporate, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riß, Deutschland

Jochen Huber

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KB und CMW entwarfen die Experimente, interpretierten die Ergebnisse, verfassten das Manuskript und erstellten Abbildungen. KB führte die bioinformatische Analyse durch und CMW führte die In-vivo- und In-vitro-Experimente durch. CV und WR entwarfen und führten die RNA-Sequenzierung durch, HW unterstützte die histologische Analyse und TL die AAV-Produktion. HF und JH überwachten die In-vivo-Experimente und NZ unterstützte die In-vitro-Experimente. FF, RAB, HK und NHR betreuten das Projekt und überarbeiteten das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und zur Überarbeitung beigetragen.

Korrespondenz mit Kolja Becker.

Alle Autoren sind Mitarbeiter von Boehringer Ingelheim und die Studie wurde vollständig von Boehringer Ingelheim finanziert.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Becker, K., Weigelt, CM, Fuchs, H. et al. Transkriptomanalyse von AAV-induzierten Retinopathiemodellen, die menschliches VEGF, TNF-α und IL-6 in Mäuseaugen exprimieren. Sci Rep 12, 19395 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23065-4

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Eingegangen: 20. April 2022

Angenommen: 25. Oktober 2022

Veröffentlicht: 12. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23065-4

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