Entschlüsselung der DNA-Sequenzen, die in Membranvesikeln von Streptomyces coelicolor enthalten sind

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 16651 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Membranvesikel (MVs) sind kugelförmige Partikel mit nanoskaligen Abmessungen, die durch das Vorhandensein verschiedener Ladungen wie Nukleinsäuren, Proteine, Lipide und zelluläre Metaboliten gekennzeichnet sind. In der Literatur werden viele Beispiele für (Mikro-)Organismen beschrieben, die MVs produzieren. Unter ihnen sind bakterielle MVs von besonderem Interesse, da sie mittlerweile als vierter Mechanismus des horizontalen Gentransfers gelten. Streptomyces-Bakterien sind bekannt für ihre ökologische Rolle und ihre Fähigkeit, bioaktive Verbindungen zu synthetisieren, wobei Streptomyces coelicolor der Modellorganismus ist. Es wurde zuvor gezeigt, dass es unterschiedliche Populationen von MVs produzieren kann, die durch unterschiedliche Protein- und Metabolitenladungen gekennzeichnet sind. In dieser Arbeit haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass MVs von S. coelicolor sowohl DNA als auch RNA tragen und dass ihr DNA-Inhalt das gesamte Chromosom des Bakteriums darstellt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass MV-DNA eine Rolle bei der Entwicklung von Streptomyces-Genomen spielen könnte und dass MVs in neuen Strategien zur Stammentwicklung genutzt werden könnten.

Bakterielle Membranvesikel (MVs) sind kugelförmige und membranartige Partikel mit einem Durchmesser im Nanometerbereich und ihre Ladung umfasst verschiedene Makromoleküle – wie Nukleinsäuren (DNA und RNA), Lipide und Proteine ​​(d. h. Enzyme und Toxine) – und kleine Moleküle – wie z. B. zelluläre Metaboliten, Signale und bioaktive Moleküle (z. B. Antibiotika)1,2,3,4. Die Freisetzung von MVs kann viele biologische Funktionen wie Nährstoffaufnahme, Konkurrenz, Überleben, Stressreaktion, interzelluläre Kommunikation und horizontalen Gentransfer (HGT)1,3,5 erleichtern. Im Kontext der HGT, die als eine der Hauptkräfte bei der Gestaltung von Genen und Genomen sowie deren Evolution gilt6, könnten die MVs eine (sehr) wichtige Rolle spielen. Die wichtigsten untersuchten Mechanismen von HGT in Prokaryoten sind Transformation, Konjugation und Transduktion6,7. In den letzten Jahren wurden MVs jedoch als der vierte Mechanismus der HGT angesehen, der als Vesiduktion bezeichnet wird5,8,9,10. Tatsächlich wurden verschiedene Arten von genetischem Material, wie chromosomale, Plasmid- und/oder Phagen-DNA, zusammen mit sRNA, mRNA und miRNA in MVs oder in Verbindung mit ihrer Membran nachgewiesen5,8,9,11. Das Auftreten von HGT, das durch MVs vermittelt wird, wurde in vielen Studien beobachtet: Beispielsweise zeigten Klieve et al.12 zum ersten Mal die Assoziation von DNA mit MVs, die von grampositiven Bakterien der Gattung Ruminococcus freigesetzt werden, und die Fähigkeit dazu dieser MVs, um eine spezifische Stoffwechselaktivität in Mutantenstämmen wiederherzustellen12. Darüber hinaus wurde berichtet, dass MVs Plasmide zwischen verschiedenen Stämmen 13,14 und DNA-Fracht in eukaryontische Wirtszellen übertragen 15.

Darüber hinaus ist extrazelluläre DNA (eDNA) ein wichtiger Bestandteil der bakteriellen Biofilmmatrix und ermöglicht die Zelladhäsion in den frühen Stadien der Biofilmbildung. In Streptococcus mutans-Planktonzellen wird eDNA auch durch einen lyseunabhängigen Modus freigesetzt, an dem MVs beteiligt sind. Daher könnte eDNA in MVs planktonischer Kulturen eine gewisse Rolle im frühen Stadium der Biofilmbildung spielen und die bakterielle Besiedlung fördern. Darüber hinaus wird berichtet, dass MV-eDNA die strukturelle Integrität und Stabilität des Biofilms beeinflusst16.

Nur 4 % der zwischen 1972 und 2021 durchgeführten Studien zu prokaryotischen Membranvesikeln befassen sich mit MVs grampositiver Bakterien17: Tatsächlich wurde lange Zeit angenommen, dass grampositive Bakterien aufgrund des Fehlens einer äußeren Membran keine Vesikel produzieren könnten Membranschicht und das Vorhandensein dicker Zellwände1. In den letzten Jahren haben grampositive MVs mehr Aufmerksamkeit erlangt und ihre Freisetzung wurde sowohl in pathogenen als auch in nicht pathogenen Stämmen nachgewiesen, wie z. B. Staphylococcus spp., Bacillus spp., Lactobacillus spp. und Streptomyces spp.4,18,19, 20,21.

Streptomyces ist eine Gattung filamentöser grampositiver Bakterien, die in terrestrischen und marinen Umgebungen allgegenwärtig sind und dort in Symbiose leben können, beispielsweise mit Pflanzen, Pilzen, Insekten und Schwämmen22: Anpassung an so unterschiedliche ökologische Nischen und Interaktion mit anderen ( Mikroorganismen haben zu einer besonderen chemischen Vielfalt ihrer bioaktiven Metaboliten geführt, deren Produktion durch ein komplexes Netzwerk von Umweltsignalen wie Nährstoffmangel und Anwesenheit von Konkurrenten reguliert wird22,23,24. Streptomyceten haben einen komplexen Lebenszyklus, da das Myzel einer Kolonie aus unterschiedlichen Zelltypen (z. B. vegetativen Hyphen, Lufthyphen und Sporen) und sogar unterschiedlichen Subpopulationen besteht: Tatsächlich wurden Streptomyces-Kolonien kürzlich als ähnlich zu Kolonien sozialer Insekten beschrieben mit Arbeitsteilung aufgrund des Vorhandenseins mutierter Zellsubpopulationen, die durch Deletionen und/oder Amplifikationen in den Armen ihrer linearen Chromosomen gekennzeichnet sind und die Antibiotika auf Kosten ihrer eigenen Fitness überproduzieren25,26.

Bei diesen Bakterien ist die Konjugation der am besten untersuchte Mechanismus der HGT, da sie seit den 1950er Jahren in Experimenten mit prototrophen Stämmen und auxotrophen Mutanten untersucht wurde27,28,29. Ein besonderes Merkmal der Konjugation bei Streptomyces ist die Bildung sogenannter Pocken: Wenn Sporen eines Stammes, der ein Plasmid trägt, zusammen mit einem Überschuss an Sporen des Empfängerstamms kultiviert wurden, bildeten sich kreisförmige Zonen mit Wachstumsverzögerung im Myzelrasen des Empfängers beobachtet30. Der Pocking-Phänotyp war mit dem Plasmidtransfer verbunden, da das Donorplasmid in den Zellen gefunden wurde, die den Pock30 bildeten. Während in einzelligen Bakterien außerdem konjugative Plasmide als einzelsträngige DNA vom Spender zum Empfänger über ein Typ-IV-Sekretionssystem übertragen werden, an dem mehrere Proteine ​​beteiligt sind, besteht die Streptomyces-Konjugation aus der Übertragung doppelsträngiger DNA und eines vom Konjugativ kodierten Proteins Plasmid (d. h. TraB) ist erforderlich31,32,33,34,35,36.

Streptomyces coelicolor gilt als Modellorganismus für die Untersuchung von Streptomyceten. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass S. coelicolor, der in Flüssigkulturen gezüchtet wird, MVs unterschiedlicher Größe und mit spezifischen Protein- und Stoffwechselladungen freisetzt4. Es ist jedoch immer noch nicht klar, ob bestimmte DNA-Fragmente oder der gesamte Satz genomischer Sequenzen von Streptomyces von MVs getragen werden können. Daher bestand das Ziel dieser Arbeit darin, die Sequenzierung und Analyse der aus S. coelicolor-MVs gereinigten DNA durchzuführen, um zu überprüfen, ob die gesamte chromosomale DNA möglicherweise mit MVs assoziiert ist.

Zwei Hauptpopulationen von MVs, nämlich F3- und F4-MVs, wurden aus Flüssigkulturen von S. coelicolor gemäß dem in Materialien und Methoden angegebenen Protokoll isoliert und gereinigt. Diese beiden MV-Populationen wurden zuvor charakterisiert: Sie hatten nicht nur unterschiedliche Durchmesser (die durchschnittliche Größe betrug etwa 100 nm bzw. 200 nm in F3 bzw. F4), sondern unterschieden sich auch in der Zusammensetzung ihrer Protein- und Metabolitenladungen4. Alle sechs Gradientenfraktionen wurden direkt auf ein 1 %iges (Gew./Vol.) Agarosegel geladen und diese Elektrophoreseanalyse ergab das Vorhandensein von drei Hauptbanden: zwei kleinere Banden, die etwa 900 bp bzw. 500 bp entsprechen, und eine Bande mit höherem Molekulargewicht von ca. 19 kb (Abb. 1). Früheren Arbeiten zufolge wurden F3 und F4 für weitere Untersuchungen ausgewählt, da es sich dabei um die am stärksten mit MV angereicherten Gradientenfraktionen handelt4,37. Darüber hinaus wurde das Vorhandensein von MVs in F3 und F4 durch dynamische Lichtstreuungsanalyse (DLS) bestätigt (ergänzende Abbildung S1).

Elektrophoretische Analyse der Nukleinsäuren, die mit den Fraktionen F3 und F4 von S. coelicolor MVs assoziiert sind. M: DNA-Molekulargewichtsmarker IV (Roche).

Die relativen Intensitäten der drei Banden zeigten ein gegensätzliches Muster zwischen den beiden MV-Populationen: In F3 erschien die 19-kb-Bande im Vergleich zu den anderen heller, während in der F4-Fraktion die Intensitäten der 900-bp- und 500-bp-Banden stärker waren als die Bande mit hohem Molekulargewicht. Um die in den F3- und F4-Fraktionen vorhandenen Nukleinsäuren zu identifizieren, wurden diese entweder mit RNase oder DNase behandelt. Die erhaltenen Daten zeigten, dass die beiden kleineren Banden beider Fraktionen RNA entsprachen, während es sich bei der hochmolekularen Nukleinsäure um DNA handelte (ergänzende Abbildung 2).

PCR-Experimente zur Identifizierung des DNA-Gehalts von F3 und F4 wurden durchgeführt, indem Teile der Genkartierung in verschiedenen Regionen des S. coelicolor-Chromosoms amplifiziert wurden. Zu diesem Zweck wurden katA2, catC, dnaK, hrdB und rrnB als Zielgene ausgewählt (Abb. 2).

Karte des S. coelicolor A3(2) M145-Chromosoms. Die Positionen von katA2, catC, dnaK, hrdB und rrnB werden angegeben. Die Karte wurde mit der Software SnapGene Viewer unter Verwendung der Sequenz von S. coelicolor A3(2) erstellt, die in GenBank unter der Zugangsnummer AL645882.2 verfügbar ist.

Die erhaltenen Daten zeigten, dass aus beiden Fraktionen fünf Amplikons der erwarteten Größe erhalten wurden, was darauf hindeutet, dass der DNA-Gehalt von F3 und F4 das S. coelicolor-Chromosom widerspiegelte (ergänzende Abbildung S3).

Um zu überprüfen, welche Regionen des S. coelicolor-Chromosoms mit den MVs assoziiert waren, wurde Next-Generation Sequencing (NGS) der DNA aus F3 durchgeführt: F3 wurde für diese Analyse ausgewählt, da es sich um die am stärksten mit DNA angereicherte Fraktion handelte. Die DNA-Sequenzierung ergab 7.692.359 Paarendsequenzen, von denen 3.831.272 den Trimmschritt bestanden. Während des Assemblierungsschritts wurden 411 Contigs mit N50 = 62.711 bp, GC% = 72,18 % und einer Gesamtlänge von 8.580.830 bp erhalten. Für das weitere Scaffolding, das mit der MeDuSa-Software durchgeführt wurde, wurden nur die 255 Contigs verwendet, die länger als 1000 bp waren und insgesamt 8.545.699 bp ausmachten (siehe Materialien und Methoden). Das resultierende Gerüst enthielt einen einzelnen Contig von 8.558.499 bp mit GC% = 72,07 % und 128 Lücken. Die Analyse der durchschnittlichen Nukleotididentität (ANI) bestätigte, dass das zusammengesetzte Genom zu S. coelicolor gehörte: Tatsächlich hatten 13 von 15 Referenzgenomen einen ANI-Wert von > 99,9 %, wie in der Ergänzungstabelle S2 angegeben. Die beiden niedrigsten ANI-Werte waren wahrscheinlich auf die Qualität der entsprechenden Referenzgenome zurückzuführen; tatsächlich hatten sie eine größere Anzahl von Contigs und kleinere N50-Werte (Ergänzungstabellen S1–S2).

Als die Sequenzierungsablesungen auf die Referenzchromosomensequenz von S. coelicolor A3(2) abgebildet wurden (Abb. 3), zeigte die Analyse, dass die Reads die gesamte Genomsequenz abdeckten, wie die PCR-Daten nahelegen.

Kartierung der Sequenzierungsablesungen auf der Referenzchromosomensequenz von S. coelicolor A3(2). (A) Sequenzabdeckung des S. coelicolor A3(2)-Chromosoms. (B) Zoom der Region zwischen den Positionen 5.100.000 und 5.130.000 des Referenzgenoms AL645882.2.

Es ist bemerkenswert, dass die durchschnittliche Leseabdeckung zwar 117,5-fach betrug, eine ~ 17 kb lange Region des Chromosoms (von Position 5.106.161 bis 5.122.930 des Referenzgenoms mit der Zugangsnummer AL645882.2) jedoch mit einer lokalen durchschnittlichen Abdeckung von überrepräsentiert war 1288,5X und einschließlich der 25 in Tabelle 1 aufgeführten ORFs.

Insgesamt zeigten diese Daten, dass der DNA-Gehalt der MV-Population repräsentativ für das gesamte S. coelicolor-Chromosom ist.

Das Ziel dieser Arbeit war die Sequenzierung und Analyse der DNA-Fracht, die von den MVs von S. coelicolor getragen wird, da wir zum ersten Mal gezeigt haben, dass zwei Hauptpopulationen von MVs, die aus Flüssigkulturen von S. coelicolor isoliert wurden, Nukleinsäuren enthalten. Insbesondere ist eine davon (also Fraktion F3) mit DNA und die andere (also Fraktion F4) mit RNA angereichert. Darüber hinaus zeigte die DNA-Sequenzierung, dass die von den MVs der Fraktion F3 getragene DNA repräsentativ für die gesamte S. coelicolor ist. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Arbeiten zu Außenmembranvesikeln (OMVs) von Pseudomonas aeruginosa und Dinoroseobacter shibae überein und zeigt das Vorhandensein des gesamten Genoms in OMVs15,38: Darüber hinaus wurde gezeigt, dass in D. shibae eine spezifische DNA-Region von sein Chromosom war überrepräsentiert und erinnerte an das hier bei S. coelicolor38 beobachtete Muster; Obwohl diese Region im Fall von D. shibae den Replikationsterminus (ter) seines zirkulären Chromosoms umfasste und die Überrepräsentation auf die Reparatur überreplizierter DNA zurückzuführen sein könnte, ist immer noch nicht klar, ob diese Sequenzanreicherung eine biologische Bedeutung hat der Fall von S. coelicolor. Beispielsweise enthält diese Region des S. coelicolor-Chromosoms weder den Replikationsursprung (oriC), dessen Position in der Referenzsequenz 4.269.853–4.272.747 ist, noch die bekannten ParB-Bindungsstellen (d. h. parS), die in einem ~ abgebildet sind 400 kb umfassende Region, zentriert auf dem oriC40.

Insgesamt untermauern diese Ergebnisse das Konzept, dass die Produktion von (O)MVs einen weit verbreiteten HGT-Mechanismus darstellen könnte, der sowohl gramnegative als auch grampositive Bakterien umfasst und zur Entwicklung von Genen und Genomen beiträgt. Die Gattung Streptomyces gehört zu den Hauptproduzenten bioaktiver Verbindungen, darunter Antibiotika zur Behandlung menschlicher Infektionen; Daher ist das Vorhandensein chromosomaler DNA in S. coelicolor-MVs von relevantem Interesse. Tatsächlich sind Antibiotikaresistenzgene (ARGs) normalerweise Teil biosynthetischer Gencluster und können in der Umwelt verbreitet und direkt oder indirekt von anderen Bakterien, einschließlich Krankheitserregern, erworben werden. In diesem Zusammenhang haben Jiang et al.41 die mögliche HGT von ARGs von Streptomyces bis zu Proteobakterien, einschließlich Krankheitserregern, vorgeschlagen41.

Verschiedene Studien deuten darauf hin, dass DNA im Lumen und/oder auf der Oberfläche von MVs lokalisiert sein kann: In beiden Fällen scheint DNA unabhängig von ihrer Lokalisierung in der Lage zu sein, HGT9,15,42 zu vermitteln. Sogar im Fall von DNA, die mit der Oberfläche von (O)MVs assoziiert ist, wurde gezeigt, dass diese DNA an der HGT beteiligt ist: Beispielsweise wurde berichtet, dass die DNase-Behandlung von OMVs aus Porphyromonas gingivalis die Effizienz des Gentransfers beeinträchtigt8,43. Die Lokalisierung der mit MVs assoziierten DNA hängt wahrscheinlich von ihrer Biogenese ab, und zwar entweder in Bezug auf lebensfähige oder sterbende Zellen: Im letzteren Fall könnte DNA beispielsweise auch durch Anhaften an der Oberfläche freigesetzter Vesikel mit MVs assoziiert sein44. Diese Art der Ladungsbeladung könnte bei Streptomyces wahrscheinlich sein, da der programmierte Zelltod bekannt ist und eine relevante Rolle bei der morphophysiologischen Differenzierung dieser Bakterien spielt45,46.

Drei mögliche Mechanismen der MV-vermittelten HGT wurden vorgeschlagen: (i) MV bewegt sich näher an die Zielzelle und die DNA auf ihrer Oberfläche wird von der Zelle durch natürliche Kompetenz erworben; (ii) MV, das mit der Membran der Zielzelle verbunden ist, wird einer Lyse unterzogen und DNA wird durch natürliche Kompetenz erworben; (iii) die MV-Membran verschmilzt mit der der Zielzelle und die Ladung wird so in die Zelle transportiert42,47.

Die Rolle der MV-DNA in der Genomentwicklung ist verlockend und vielversprechend; Da DNA jedoch auf der Außenfläche von MVs lokalisiert sein kann, kann nicht a priori ausgeschlossen werden, dass DNA in erster Linie eine architektonische Funktion bei der MV-Bildung ausübt und/oder die mechanische Unterstützung für die Formerhaltung nach der Sekretion von MVs bereitstellt. Darüber hinaus könnte die DNA von Streptomyces MV eine mögliche Rolle bei der Förderung der Adhäsion von Myzelzellen an organische und anorganische Substrate oder bei der Myzelzell-Zell-Interaktion spielen, die die Klammer- und Pelletbildung in Flüssigkulturen bestimmt. Es sollte nicht überraschen, dass DNA in MVs neben HGT auch andere Funktionen ausüben kann: Tatsächlich ist bekannt, dass in menschlichen Zellen DNA, die mit extrazellulären Vesikeln assoziiert ist, mehrere Rollen haben kann, beispielsweise die Induktion von Entzündungs- und Immunreaktionen durch Aktivierung entzündungsfördernder Signale Signalwege und Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase durch die Beseitigung beschädigter DNA, die Apoptose auslösen könnte49.

Neben der physiologischen Rolle der mit MVs assoziierten DNA könnten neue Transformationsmethoden und biotechnologische Anwendungen von der DNA-Verpackung und -Lieferung durch MVs profitieren, insbesondere im Fall von Bakterien, die gegenüber den diffuseren gentechnischen Methoden widerspenstig sind. Zu diesem Zweck sollten zukünftige Arbeiten die molekularen Mechanismen identifizieren, die an der DNA-Selektion während der Produktion von MVs beteiligt sind.

Wir sind uns völlig darüber im Klaren, dass noch einige Fragen offen sind. Tatsächlich sollte beispielsweise geklärt werden, ob jedes MV (mindestens) eine vollständige Kopie des Chromosoms enthält, ob es fragmentiert ist oder nicht und ob es durch Proteine ​​gebunden und verpackt ist. Dennoch stellt diese Arbeit unserer Meinung nach einen wichtigen Fortschritt für das Verständnis der Mechanismen dar, die für die Evolution von Bakterienarten verantwortlich sind, insbesondere für solche Arten, deren Genom komplex ist, wie zum Beispiel das Streptomyces-Genom. Es ist durchaus möglich, dass die in S. coelicolor-MVs eingebettete DNA ausreichend lang ist, um Gencluster zu enthalten, die für einen einzelnen oder mehrere Stoffwechselwege verantwortlich sind. Wenn dies der Fall ist, könnten die Genome von Streptomyces und/oder näheren Arten schnelle evolutionäre Veränderungen erfahren, indem sie lange DNA-Abschnitte erwerben und die metabolische Vielseitigkeit der zu dieser Gattung gehörenden Bakterien besonders konsistent machen.

Der in dieser Studie verwendete Stamm war Streptomyces coelicolor A3(2) M145 (Genotyp SCP1− SCP2−)50. 108 Sporen wurden in 30 ml J-Medium50 für die Impfkultur inokuliert und 30 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln (200 U/min) inkubiert. Die gesammelte Biomasse wurde zweimal mit sterilem Wasser gewaschen und in 30 ml sterilem Wasser resuspendiert. Anschließend wurden 10 ml der Bakteriensuspension in 500 ml Minimalmedium [NaNO3 (1 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), KCl (0,5 g/L), KH2PO4 (1 g/L) inokuliert. , Glucose (10 g/L), Spurenelementlösung (1 ml/L), pH 7; Die Spurenelementlösung enthielt FeSO4·7H2O (1 g/100 ml), ZnCl2 (1 g/100 ml) und Biotin (0,1 g/100 ml)] (MM)51, in einem 2-L-Kolben mit Schikanen und inkubiert bei 136 h bei 30 °C unter Schütteln bei 180 U/min. S. coelicolor-Membranvesikel wurden wie zuvor beschrieben isoliert und gereinigt4. Kurz gesagt, der Kulturüberstand wurde filtriert und anschließend unter Verwendung eines Amicon Ultrafiltrationssystems mit einem 100-kDa-Ausschlussfilter (Millipore) konzentriert. Anschließend wurde es aufeinanderfolgenden Zentrifugationen bei 4.000 und 15.000 g für 15 Minuten bei 4 °C unterzogen, um Aggregate zu entfernen. Der verbleibende Überstand wurde 1 Stunde lang bei 4 °C mit 100.000 g (SW 40 Ti Rotor, Beckman Coulter) ultrazentrifugiert. Das Pellet wurde in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung – DPBS – ohne Ca2+ und Mg2+) suspendiert und mit der OptiPrep-Lösung (Sigma-Aldrich) gemischt, um eine endgültige 35 % v/v OptiPrep-Lösung zu erhalten. Ein sechsschichtiger (35, 30, 25, 20, 15 und 10 % v/v) OptiPrep-Dichtegradient wurde in einem 14-ml-Ultrazentrifugationsröhrchen angelegt und bei 140.000 g 16 Stunden lang bei 4 °C (SW 40) ultrazentrifugiert Ti-Rotor, Beckman Coulter). Die sechs Fraktionen des Dichtegradienten (F1 bis F6) wurden gesammelt und mit sterilem DPBS verdünnt und 2 Stunden lang bei 4 °C und 38.400 g (SW 55 Ti Rotor, Beckman Coulter) ultrazentrifugiert. Pellets wurden in 0,2 ml sterilem DPBS suspendiert. 10 μl aller sechs Fraktionen wurden auf einem 1 % (Gew./Vol.) Agarosegel sichtbar gemacht. F3 und F4 wurden für nachfolgende Verfahren verwendet, da sie, wie zuvor gezeigt, MVs enthielten4. Eine DLS-Analyse wurde durchgeführt, um das Vorhandensein von MVs zu bestätigen, bevor mit den Experimenten fortgefahren wurde.

5 μl F3- und F4-MVs wurden mit 1 U rekombinanter, RNase-freier DNase I (Roche) behandelt, wobei die Proben 30 Minuten lang bei 37 °C in Gegenwart des bereitgestellten Reaktionspuffers und in einem Endvolumen von 10 μl inkubiert wurden. Die Behandlung mit RNase wurde unter Verwendung von 5 μl F3- und F4-MVs und Rnase A (Roche) durchgeführt, verwendet in einer Endkonzentration von 10 ng/ml in 10 μl; In diesem Fall wurde die Inkubation 1 Stunde lang bei 37 °C durchgeführt. Behandelte und unbehandelte Proben wurden verglichen, indem die gleiche Menge an MVs auf ein 1 % (w/v) Agarosegel geladen wurde (10 μl behandelte Proben bzw. 5 μl unbehandelte Proben).

10 μl-Aliquote von F3- und F4-MVs wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers entweder mit rekombinanter DNase I, Rnase-frei (Roche) oder Rnase A (Roche) behandelt. Nach der Behandlung wurden die Proben durch 1 % (w/v) Agarosegelelektrophorese in 1X Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE) analysiert. Als DNA-Leiter wurde der gebrauchsfertige MassRuler DNA Ladder Mix (Thermo Scientific) verwendet.

Die Gene SCO7590 (katA2), SCO0560 (catC), SCO3671(dnaK), SCO5820 (hrdB) und SCOr06 (rrnB) wurden aus MVs-Proben unter Verwendung der in Tabelle 2 aufgeführten Primersätze amplifiziert. Die Reaktionsmischungen bestanden aus 1X PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl2, 0,5 μM jedes Primers, 0,2 mM dNTPs, 1 U rekombinante Taq-DNA-Polymerase (Thermo Scientific) und 1 μl F3 oder F4, verwendet als Matrize. Für die Amplifikation von SCO7590, SCO0560, SCO3671 und SCO5820 wurden die Touchdown-PCR-Bedingungen wie folgt angewendet: anfängliche Denaturierung für 3 Minuten bei 95 °C, gefolgt von einem Zyklus von 45 Sekunden bei 95 °C, 30 Sekunden bei 66 °C und 45 s bei 72 °C; ein Zyklus von 45 s bei 95 °C, 30 s bei 64 °C und 45 s bei 72 °C; ein Zyklus von 45 s bei 95 °C, 30 s bei 62 °C und 45 s bei 72 °C; 30 Zyklen von 45 s bei 95 °C, 30 s bei 60 °C und 45 s bei 72 °C. Ein letzter Elongationsschritt bei 72 °C für 10 Minuten beendete das Programm. Für SCOr06 betrugen die Temperaturwechselbedingungen 3 Minuten lang 94 °C, gefolgt von 30 Zyklen mit 45 Sekunden lang 94 °C, 1 Minute lang 50 °C und 90 Sekunden lang 72 °C und schließlich 10 Minuten lang 72 °C.

DNA aus F3 wurde von Genomix4life srl (Salerno, Italien) unter Verwendung der Illumina NextSeq550-Plattform mit einer 2 × 150 bp Paired-End-Sequenzierung sequenziert. Indizierte Bibliotheken wurden mit einem Nextera DNA Flex Kit (Illumina Inc.) erstellt. Die Lesevorgänge wurden mit Trimmomatic (v. 0.36.4)52 gekürzt: Der Adapter wurde mit der Option ILLUMINACLIP entfernt, dann wurde das Trimmen in zwei Schritten mit den Optionen SLIDINGWINDOW und MINLEN (auf 90 eingestellt) durchgeführt. Gekürzte Lesevorgänge wurden mit SPAdes (Version 3.12.0)53 mit den Optionen „—careful“ und „—cov-cutoff“ (auf „auto“ gesetzt) ​​zusammengestellt. Contigs mit einer Länge von > 1000 bp wurden mit MeDuSa54 unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle S1 angegebenen Referenzgenome von Streptomyces coelicolor aufgebaut. FastANI (v. 1.3)55 wurde verwendet, um die durchschnittliche Nukleotididentität (ANI) orthologer Genpaare im Gerüst- und Referenzgenom zu berechnen.

Zugeschnittene Lesevorgänge wurden schließlich mit Bowtie2 (v. 2.4.2)56 auf die Referenzchromosomensequenz von S. coelicolor A3(2) (verfügbar in GenBank unter der Zugangsnummer AL645882.2) abgebildet, und doppelte Lesevorgänge wurden mit Samtools Markdup (v . 1.13)57. Die Abdeckung des gesamten Genoms wurde mit der „genomecov“-Funktion von BEDTools (v. 2.30.0)58 berechnet und die Daten wurden mit dem Sushi R-Paket (v. 1.34.0)59 visualisiert. Alle diese Analysen wurden mit der auf der Galaxy-Plattform60 verfügbaren Software durchgeführt.

Rohe Sequenzierungsablesungen, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, wurden in der Sequence Read Archive (SRA)-Datenbank mit der Zugangsnummer SRR19648592 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR19648592) hinterlegt. Die BioProject-Zugangsnummer lautet PRJNA849152.

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Diese Arbeit wurde teilweise von der Regionalabteilung für produktive Aktivitäten der Region Sizilien (BIAS-Projekt, POFESR 2014/2020 Nr. 082015000275 an GG) und der Universität Palermo (FFR 2019-2020 an GG) unterstützt. Das ATeN-Zentrum (Med-CHHAB, PONa3 00273, Universität Palermo) wird für seine technische Unterstützung und Laborbewirtung gedankt.

Abteilung für biologische, chemische und pharmazeutische Wissenschaften und Technologie, Universität Palermo, 90128, Palermo, Italien

Teresa Faddetta, Giuseppe Gallo und Anna Maria Puglia

Fakultät für Biowissenschaften und Veterinärmedizin, Universität Camerino, 62032, Camerino, Italien

Albert Vassallo

Institut für Biologie, Universität Florenz, 50019, Sesto Fiorentino, Italien

Sara Del Duca & Renato Fani

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AMP und TF haben das Projekt konzipiert. TF führte die Experimente durch. AV und SDD analysierten die Daten. TF und AV haben den Manuskriptentwurf geschrieben. AMP, GG und RF haben das Manuskript überprüft und bearbeitet. AMP, GG und RF überwachten das Projekt. AMP und GG finanzierten das Projekt. Alle Autoren haben dem Papier zugestimmt.

Korrespondenz mit Alberto Vassallo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Faddetta, T., Vassallo, A., Del Duca, S. et al. Entschlüsselung der DNA-Sequenzen, die in Membranvesikeln von Streptomyces coelicolor enthalten sind. Sci Rep 12, 16651 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21002-z

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Eingegangen: 07. Juli 2022

Angenommen: 21. September 2022

Veröffentlicht: 05. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21002-z

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