Agarosegel-Mikrokapseln ermöglichen eine einfache

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 17014 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Ein neuartiger Typ von Agarose-Gel-Mikrokapseln (AGM), bestehend aus einem Alginat-Picoliter-Sol-Kern und einer Agarose-Gel-Hülle, wurde entwickelt, um hochwertige, einzellige, amplifizierte genomische DNA von Bakterien zu erhalten. Das AGM lässt sich einfach mit Standard-Laborgeräten in einer stabilen Emulsion mit Öl mit einer wasseräquivalenten Dichte herstellen, die eine AGM-Aggregation verhindert. Einzelne Zellen aus einer Reinkultur von Escherichia coli, einer Scheingemeinschaft bestehend aus 15 Stämmen menschlicher Darmbakterien und einer Termitendarmbakteriengemeinschaft wurden in AGMs eingekapselt und ihre genomischen DNA-Proben wurden mit massiv parallelen Amplifikationen in einem Röhrchen hergestellt. Die Genomsequenzierung erforderte keine Zweitrundenamplifikation und zeigte eine durchschnittliche Genomvollständigkeit, die viel höher war als die, die mit einer herkömmlichen Amplifikationsmethode im Mikrolitermaßstab erreicht wurde, unabhängig vom genomischen Guanin-Cytosin-Gehalt. Unsere neuartige Methode mit AGM wird es vielen Forschern ermöglichen, einfach und effektiv Einzelzellgenomik durchzuführen und die Genomanalyse noch nicht kultivierter Mikroorganismen beschleunigen.

Mikroorganismen sind in verschiedenen Umgebungen allgegenwärtig verbreitet. Sie sind oft mit anderen Organismen verbunden und spielen eine wichtige Rolle in Ökosystemen. Die meisten Mikrobenarten lassen sich jedoch mit herkömmlichen Methoden nur schwer kultivieren und werden als noch nicht kultivierte Mikroorganismen bezeichnet1. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden sie umfassend mit kulturunabhängigen Methoden wie der Amplikon-Sequenzierungsanalyse von ribosomalen RNA-Genen kleiner Untereinheiten (SSU rRNA) und der Shotgun-Sequenzierungsanalyse von Metagenomen untersucht. Die Metagenomik ist ein leistungsstarkes Instrument zur Untersuchung der ökologischen und physiologischen Funktionen von Mikrobiota auf der Grundlage ihres kodierten genetischen Repertoires. Die jüngste Entwicklung der rechnerischen Einteilung metagenomischer Fragmente in entsprechende mikrobielle taxonomische Anordnungen hat den Nutzen der Metagenomik 2,3 verstärkt. Durch rechnerisches Binning auf der Grundlage der Sequenzzusammensetzung, der Homologie zu Datenbanksequenzen und der Sequenzleseabdeckung jedes Fragments gelingt es jedoch häufig nicht, Genome eng verwandter (Unter-)Arten zu unterscheiden und Genomregionen, die sich von anderen unterscheiden, wie z. B. rRNA, korrekt zu sortieren Gene, Prophagen und Plasmide4,5. Darüber hinaus ist ein enormer Sequenzierungsaufwand erforderlich, um die Genomsequenzen kleinerer Arten in der mikrobiellen Gemeinschaft zu erhalten3.

Die Einzelzellgenomik, bei der die gesamte genomische DNA aus physikalisch isolierten Einzelzellen amplifiziert wird6, wurde als alternative oder ergänzende Methode verwendet, um die Stoffwechselkapazität noch nicht kultivierter Mikroorganismen aufzudecken1,7. Die Isolierung einzelner Zellen kann in vielen Fällen durch den Einsatz von Technologien wie fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS)1, Mikromanipulatoren8, mikrofluidischen Geräten9,10 und Einkapselung in Wasser-in-Öl-Tröpfchen11 erreicht werden. Obwohl verschiedene Methoden zur Amplifikation des gesamten Genoms entwickelt wurden12, wird die Multiple Displacement Amplification (MDA) unter Verwendung von Phi29-DNA-Polymerase mit Zufallsprimern aufgrund ihrer relativen Einfachheit, Zuverlässigkeit und Anwendbarkeit am häufigsten verwendet6,13. MDA weist jedoch von Natur aus eine extreme Amplifikationsverzerrung zwischen Genomregionen auf1, was die größte technische Einschränkung bei der Einzelzellgenomik darstellt. Darüber hinaus erhöht der hohe Guanin-Cytosin (GC)-Gehalt der genomischen DNA tendenziell den Amplifikationsbias1,14. Durch den Einsatz kleiner Reaktionsgefäße kann ein Amplifikationsbias unterdrückt werden; zum Beispiel Mikrokanalkammern (60 nL)10, Nanoliter-Mikrowells (12 nL)15, virtuelle Mikrofluidik (MDA in einer Gelfolie, 60 nL)16, digitale Tröpfchen, die durch Verwendung eines Mikrokanals erzeugt werden (9,5–240 pL)17,18, 19 und Gelperlen20. Allerdings stehen diese Mikrofabrikationstechniken vielen Mikrobiologen nicht zur Verfügung, und die Menge des Amplifikationsprodukts ist oft zu gering für eine direkte Genomsequenzierung; Daher ist häufig eine zweite MDA-Runde erforderlich, was letztendlich die Verstärkungsverzerrung verstärkt21.

Eine Hohlkern-Hydrogel-Mikrokapsel22, die aus einer Hydrogelhülle und einem Solkern besteht, hat Potenzial als effizientes Gefäß für Einzelzell-MDA. Es wurde berichtet, dass viele Hohlkern-Hydrogel-Mikrokapseln für die Zellkultivierung und Zelltransplantation nützlich sind23,24,25. Das MDA-Produkt aus genomischer Einzelzell-DNA, das in einem Hohlkern im Picoliter-Maßstab in einer Mikrokapsel amplifiziert wurde, wurde jedoch nicht vollständig für die Einzelzell-Genomik untersucht.

Hier stellen wir eine neuartige Einzelzell-Genomikmethode vor, die ein AGM verwendet, das aus einer Agarosegelhülle und einem Alginat-Sol-Hohlkern besteht und die Einzelzellisolierung und MDA im Picoliter-Maßstab ermöglicht (Abb. 1a). Die AGM-Herstellung wurde hier für eine einfachere Herstellung mit kostengünstigen Geräten und Reagenzien wie Vortex-Mischern, Zentrifugen und im Handel erhältlichen Reagenzien optimiert (Abb. 1b), obwohl die Größengleichmäßigkeit von AGM im Vergleich zu den Methoden mit Mikrofabrikationstechniken geopfert wird 26, 27 . Somit lässt sich diese AGM einfach vorbereiten und ist für viele Mikrobiologen skalierbar. Durch die Verwendung von AGM kann eine einzelne Bakterienzelle in ihrem Solkern im Picoliliter-Maßstab eingekapselt und dann einfach durch den Austausch von Lösungen MDA ausgesetzt werden (hier als „MDA-in-AGM“ bezeichnet). Wir zeigen anhand von E. coli, einer Scheinmischung aus menschlichen Darmbakterien, und der Darmmikrobiota von Termiten, dass MDA-in-AGM eine massiv parallele Einzelzellgenomik mit deutlich verbesserter Genomvollständigkeit im Vergleich zu einer herkömmlichen Methode mit FACS und Mikroliter-Genen ermöglicht. Skala MDA (FACS-MDA).

Schematische Darstellung einer Agarosegel-Mikrokapsel (AGM) und ihres Herstellungsprozesses. (a) Schematische Darstellung der in dieser Studie entwickelten AGM zur Einzelzellisolierung und Multiple Displacement Amplification (MDA). Das AGM besteht aus einer Agarose-Hydrogel-Hülle und einem Alginat-Sol-Kern. Der Alginatkern stellt eine Reaktionskammer im Picoliter-Maßstab für MDA dar, während die Agarosehülle sowohl als durchlässige Hülle für Enzyme und kleine Moleküle als auch als Schutzwand gegen größere Partikel und Moleküle wie Bakterienzellen und genomische/amplifizierte DNA fungiert. (b) Vorbereitungsschema für AGMs, die Escherichia coli-Zellen enthalten. Die Alginatkerne und Agaroseschalen werden mit Ca2+ aus CaCO3 geliert und jeweils in einer Emulsion gekühlt. Polyglyceryl-6-Octacaprylat (PGO) kann die Aggregation von AGMs während der Agarose-Gelierung durch Kühlung unterdrücken. Abschließend werden die Alginat-Gelkerne mit EDTA durch Chelatisierung von Ca2+ solisiert. ISA-Isostearylalkohol.

Für AGM-Kerne wurden Alginat-Gelkügelchen mit Bakterienzellen unter Verwendung der Emulgierungs-/internen Gelierungsmethode27 hergestellt (Abb. 1b). Kurz gesagt wurde eine Mischung aus Alginatlösung, Bakterienzellen und CaCO3-Nanopartikeln mit Isostearylalkohol (ISA) emulgiert. Die resultierenden Mikrotröpfchen wurden mit Calciumionen geliert, die durch Zugabe von Essigsäure zur Wasser-in-Öl-Emulsion aus CaCO3-Nanopartikeln freigesetzt wurden. Die Konzentration der Bakterienzellen wurde mithilfe serieller Verdünnungen optimiert, sodass ein Alginat-Mikrotröpfchen eine oder keine Bakterienzellen enthielt. Die resultierenden Alginat-Gelkerne wurden nacheinander mit Diethylether, 1-Butanol und Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gewaschen.

Anschließend wurde Agaroselösung (SeaPlaque, Lonza; Endkonzentration 2 %) zu den in Tris-HCl (pH 7,5) suspendierten Alginatgelkernen bei 35 °C gegeben und die Mischung mit 0,25 % (v/v) Span 85 in emulgiert Polyglyceryl-6-Octacaprylat (PGO) bei 35 °C (Abb. 1b). PGO wurde hier verwendet, weil seine Dichte wasseräquivalent ist (0, 997 g/ml) und PGO daher Wasser stabil emulgierte (ergänzende Abbildung S1a), die Agarosegelaggregation verhinderte (S1b) und die Durchmesser (S1c und S1d) und Ausbeuten erhöhte (S1e) von Agarosegeltröpfchen. Die Agarose-Tröpfchen gelierten nach und nach in der stabilen Emulsion durch Abkühlen auf 4 °C. Nachdem PGO durch Mischen mit Diethylether und anschließend mit 1-Butanol entfernt wurde, wurden die Alginatgelkerne mit einem Zehntel Volumen 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) solisiert. Die Isolierung der Alginatkerne wurde durch Markieren der Alginatkerne mit Rhodamin 123 und Beobachten der Diffusion des Farbstoffs in den Puffer beim Schmelzen der Agarosegelhüllen in Gegenwart von EDTA verifiziert, wohingegen die Alginatkerne mit 50 mM CaCl2 (Ergänzung) in Gelform blieben Abb. S2). Der Alginat-Sol-Kern bietet einen geeigneten Raum für die MDA-Reaktion, was durch die viel höheren Ausbeuten an amplifizierter DNA gezeigt wurde als bei Reaktionen mit einem Alginat-Gel-Kern oder Agarosegel-Kügelchen, wie unten beschrieben. Die AGMs wurden mit Tris-EDTA (TE)-Puffer (pH 7,4) gewaschen, um überschüssiges EDTA zu entfernen, in einem halben Volumen TE-Puffer suspendiert und bei 4 °C gelagert. Der gesamte Prozess der Hauptversammlungsvorbereitung kann in 7 Stunden erledigt werden.

Als Modellmikroorganismus wurde Escherichia coli DH5α verwendet. E. coli-Zellen wurden in einer Konzentration von 3 × 106 Zellen ml-1 zu einer Alginat-CaCO3-Lösung gegeben und in drei unabhängigen Experimenten in 5,64 ± 1,72 × 105 AGMs (Mittelwert ± Standardabweichung) eingekapselt, was 12,5 % ± 5,4 % entsprach. der gesamten Hauptversammlungen. Von den AGMs, die E. coli-Zellen enthielten, enthielten etwa 94 % eine einzelne Zelle im Kern (Ergänzungstabelle S1). In den drei unabhängigen Experimenten betrugen die Durchmesser der vorbereiteten Hauptversammlungen 39,6 ± 22,2 µm, 51,4 ± 13,3 µm und 49,3 ± 19,6 µm (Ergänzende Abbildung S3a). AGM-Durchmesser und Kernvolumina zeigten Normalverteilungen bzw. logarithmische Normalverteilungen (Ergänzende Abbildungen S3b, S4). Das durchschnittliche mittlere AGM-Kernvolumen in den drei Experimenten betrug 15,1 ± 6,3 pL (n = 3).

AGMs (in 50 µL Suspension) wurden mit sterilem Wasser gewaschen und durch Zentrifugation gesammelt. Die Lyse von Bakterienzellen und die Denaturierung doppelsträngiger DNA innerhalb der AGMs wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 50 µL einer alkalischen Lösung durchgeführt, bei der es sich um Puffer D2 des REPLI-g UltraFast Mini Kit (Qiagen) handelte. Die Denaturierung wurde durch Neutralisierung durch Zugabe eines gleichen Volumens der Stopplösung aus dem Kit gestoppt und der Überstand wurde dann durch Zentrifugation entfernt. Reaktionspuffer (93,5 µL) mit 11 µL REPLI-g UltraFast DNA Polymerase aus dem Kit wurde hinzugefügt und die resultierende Mischung 3 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Die Reaktion wurde mit einem Zehntel Volumen 0,5 M EDTA gestoppt und die AGMs wurden dreimal mit 200 µL TE-Puffer gewaschen. Alle in der MDA- und AGM-Zubereitung verwendeten Reagenzien wurden vor der Verwendung mit ultraviolettem Licht bestrahlt, um jegliche kontaminierende DNA abzubauen.

Unter den 4,6 ± 2,9 × 105 AGMs, die mit E. coli-Zellen hergestellt wurden, zeigten 8,9 % ± 0,8 % eine DNA-Amplifikation, was 77,0 % ± 27,2 % der AGMs mit E. coli-Zellen (n = 3) entsprach (Ergänzungstabelle S1). . Wie in Abb. 2 gezeigt, füllte amplifizierte DNA den Alginat-Solkern, wohingegen AGMs mit Alginat-Gelkernen, die ohne den Solierungsschritt mit EDTA hergestellt wurden, oder Agarosegelkügelchen, die keinen Alginatkern enthielten, nur eine begrenzte oder keine DNA-Amplifikation durch MDA zeigten.

Ertragssteigerung der Multiple Displacement Amplification (MDA) durch Alginatkernsolierung. Die Wirkung der Alginatkernsolierung auf die Produktivität von MDA in Agarosegel-Mikrokapseln (AGMs) wurde bewertet. Die in AGMs eingekapselte genomische DNA von Escherichia coli wurde durch MDA mit oder ohne Alginatlösung unter Verwendung von EDTA amplifiziert. Die amplifizierte DNA wurde mit SYBR Green I nachgewiesen. Ein Phasenkontrastbild (rot) und ein Epifluoreszenzbild (grün, SYBR Green I) werden überlagert. Als Kontrollexperiment wurde auch MDA in Agarose-Gelkügelchen (ohne Alginatkern) durchgeführt, das durch Gelierung von Agarose-Tröpfchen mit E. coli-in-Öl-Emulsion hergestellt wurde. Pfeile zeigen mit SYBR Green I gefärbte E. coli-Zellen. Balken = 100 µm.

Die Qualität der Einzelzell-amplifizierten Genome (SAGs) unter Verwendung von MDA-in-AGM wurde bewertet und mit der Qualität von FACS-MDA verglichen. AGMs, die mit SYBR Green I gefärbte amplifizierte DNA enthielten, wurden einzeln in 0,2-ml-PCR-Röhrchen mit 29 µl sterilem Wasser unter einem Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem TransferMan NK2-Mikromanipulator (Eppendorf) ausgestattet war, überführt, was etwa 5 Minuten pro AGM erforderte. Der Mikromanipulator wurde in dieser Studie aufgrund seiner geringen Anschaffungskosten verwendet. Mehrere Dutzend der ausgewählten Hauptversammlungen wurden wie folgt sequenziert. Die amplifizierte DNA im AGM wurde durch 5-minütiges Erhitzen der Röhrchen auf 60 °C in Wasser freigesetzt und direkt zur Herstellung von Sequenzierungsbibliotheken unter Verwendung des QIAseq FX DNA Library Kit (Qiagen) verwendet. Es war keine zweite MDA-Runde erforderlich, um für die Genomsequenzierung geeignete Bibliotheken zu erhalten. Paired-End-Sequenz-Reads wurden auf einer Illumina MiSeq-Plattform mit dem Reagent Kit V3 (600 Zyklen) generiert, und eine feste Anzahl von Read-Paaren wurde zufällig ausgewählt und mithilfe von SPAdes 3.13.028 nach Standardqualitätsfilterung de novo zu Contigs zusammengesetzt. Für die nachfolgenden Analysen wurden Contigs > 1 kb verwendet. Mehrere Faktoren, die die Qualität der Genomsequenz beschreiben, einschließlich Vollständigkeit und Kontaminationsrate, wurden mit CheckM29 und QUAST30 bewertet und zwischen den mit MDA-in-AGM und FACS-MDA erhaltenen SAGs verglichen.

Die Vollständigkeit des Genoms und die Gesamtsequenzlänge der durch MDA-in-AGM erhaltenen E. coli-SAGs stiegen während des Sequenzierungsaufwands schnell an, und die durchschnittliche Vollständigkeit des Genoms erreichte 93,3 % ± 4,1 % (n = 10) für Assemblies mit 60-facher Abdeckung , während sie im FACS-MDA (Student-t-Test, P <0,01) 33,7 % ± 17,3 % (n = 10) betrug (Abb. 3a, Ergänzungstabelle S2). Das abgedeckte Genom, das durch Zuordnung von Lesevorgängen zur Referenzgenomsequenz von E. coli DH5α (BOCF01000000) berechnet wurde, betrug 97,4 ± 2,1 % in MDA-in-AGM (n = 10), was viel höher war als 47,8 % ± 13,5 % in FACS-MDA (n = 10) für 60-fache Abdeckungsablesungen (P <0,01) (Ergänzungstabelle S2). Der steile Rückgang der Anzahl der Contigs, dh der reibungslosen Anordnung der Contigs, bei MDA-in-AGM entlang der Tiefe des Sequenzierungsaufwands war wahrscheinlich auf die geringere Amplifikationsverzerrung zurückzuführen (Abb. 3a). Darüber hinaus war die Amplifikationsverzerrung zwischen Genomregionen, die MDA innewohnt, bei MDA-in-AGM im Vergleich zu FACS-MDA deutlich verbessert (Abb. 3b). Der Amplifikationsbias von SAGs wurde weiter mithilfe von Gini-Koeffizienten und Lorenz-Kurven bewertet, die die Populationsunterschiede als Indizes und Diagramme anzeigen. Die Gini-Koeffizienten der SAGs, die durch MDA-in-AGM erhalten wurden, waren viel niedriger als die von FACS-MDA (Welch-t-Test, P <0,01), was auf eine höhere Gleichmäßigkeit der MDA-in-AGMs als die FACS-MDAs hinweist (ergänzende Abbildung). . S5a). In der Lorenz-Kurve zeigten die durch MDA-in-AGM erhaltenen SAGs eine höhere Amplifikationsgleichmäßigkeit als die durch FACS-MDA (ergänzende Abbildung S5b). Weitere Qualitätsmetriken von SAGs, die alle Sequenzlesevorgänge verwenden, sind in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt.

Vergleich der Genomvollständigkeit und des Amplifikationsbias von Einzelzellgenomen, die durch MDA-in-AGM und FACS-MDA erhalten wurden. (a) Vollständigkeit und Anzahl der SAG-Contigs während des Sequenzierungsprozesses. Box-and-Violine-Plots (blau: MDA-in-AGM; rot: FACS-MDA) werden für Escherichia coli und zwei Bakterienarten als Beispiele aus der Scheingemeinschaft menschlicher Darmbakterien gezeigt (Ergänzungstabellen S2, S5 und S6). In den Diagrammen werden Datenpunkte (violette Kreise) und ihre arithmetischen Mittelwerte (Rhombus) angezeigt. In den E. coli-Diagrammen werden auch die Ergebnisse für DNA angezeigt, die aus kultivierten E. coli-Zellen ohne MDA hergestellt wurde (grüne Kreise). In den linken Feldern werden signifikante Unterschiede mit Sternchen (P < 0,05) oder doppelten Sternchen (P < 0,01) gekennzeichnet. (b) Die Anzahl der auf Genomregionen abgebildeten Sequenzablesungen wird als Indikator für die während der MDA verursachte Amplifikationsverzerrung angezeigt. Die Anzahl der Lesevorgänge, die verschiedenen Abdeckungen entsprechen, die für die De-novo-Assemblierung (angezeigt als „Cov.“) und die Genomvollständigkeit (%) („Compl.“) verwendet werden, die mithilfe von CheckM geschätzt wurden, werden angezeigt.

Um die Machbarkeit von MDA-in-AGM in einer realistischeren Stichprobe zu bewerten, haben wir eine Scheingemeinschaft bestehend aus 15 kultivierten Stämmen menschlicher Darmbakterien aufgebaut. Die Taxonomie und Zusammensetzung jedes Bakterienstamms, die mithilfe der 16S-rRNA-Amplikonanalyse oder der Metagenomanalyse geschätzt wurden, sind in der Ergänzungstabelle S4 aufgeführt. SAGs aus der Mock-Community wurden entweder mit MDA-in-AGM oder FACS-MDA auf die gleiche Weise wie oben erhalten. Die taxonomische Zusammensetzung der SAGs war bei MDA-in-AGM und FACS-MDA ähnlich, wobei beide erfolgreich SAGs der meisten Stämme wiederherstellten, die mit Ausnahme von Faecalibacterium prausnitzii > 5 % der Scheingemeinschaft ausmachten (Ergänzungstabelle S4). Beispielsweise zeigten die SAGs von Bacteroides thetaiotaomicron und Parabacteroides distasonis deutliche Unterschiede zwischen MDA-in-AGM und FACS-MDA hinsichtlich der Vollständigkeit des Genoms, der Anzahl der Contigs und der Amplifikationsverzerrung, wie in den E. coli-SAGs zu sehen ist (Abb. 3, ergänzende Abb . S5). Da viele aus Umweltproben gewonnene SAGs aufgrund des Fehlens ihrer Referenzgenome bei gleicher Abdeckung schwer zu vergleichen waren, wurden die Schein-SAGs in den folgenden Experimenten unter Verwendung von 0,3 M Lesepaaren zusammengestellt. Die Gesamtvollständigkeit des Genoms von SAGs mit < 5 % Kontamination war bei MDA-in-AGM signifikant höher (68,0 % ± 23,3 %, n = 39) als bei FACS-MDA (42,4 % ± 20,5 %, n = 36) (P < 0,01) (Ergänzungstabellen S5, S6). Die SAGs der meisten anderen Stämme zeigten ebenfalls ähnliche Ergebnisse wie die SAGs von E. coli (ergänzende Abbildung S6).

Die meisten Sequenzablesungen wurden ihren jeweiligen Referenzgenomen zugeordnet: Die mittleren Kartierungsraten betrugen 95,1 % und 97,6 % für SAGs von MDA-in-AGM bzw. FACS-MDA (Ergänzungstabelle S7). Obwohl die Kreuzkontaminationsraten bei MDA-in-AGM etwas höher waren als bei FACS-MDA, lagen beide unter 5 % (Ergänzungstabelle S7). In Ba. Thetaiotaomicron SAGs, Sequenz liest von einem Ba. Das Taiotaomicron-Plasmid wurde ebenfalls erhalten (Ergänzungstabelle S7). Unsere Ergebnisse zeigten, dass MDA-in-AGM auf verschiedene Bakterienarten anwendbar ist und die Genomvollständigkeit sowohl bei grampositiven als auch bei gramnegativen Bakterien verbessert, unabhängig von ihrem GC-Gehalt (Abb. 4). Für Fa. prausnitzii, ist es möglich, dass der Zelllyseprozess unter Verwendung von KOH nicht effektiv war und daher weder in MDA-in-AGM noch in FACS-MDA SAGs erhalten wurden.

Beziehungen zwischen der Vollständigkeit des Genoms und dem GC-Gehalt von Einzelzellgenomen in der Scheingemeinschaft menschlicher Darmbakterien. Einzelzell-amplifizierte Genome (SAGs) aus der Scheingemeinschaft, bestehend aus 15 Stämmen menschlicher Darmbakterien, werden mit ihrem GC-Gehalt gegen die Vollständigkeit ihres Genoms aufgetragen. Die SAGs wurden aus 0,3 Mio. zufällig ausgewählten Lesepaaren zusammengestellt, während MS485-1-51 von MDA-in-AGM (0,26 Mio. Lesepaare) und CS1–94 von FACS-MDA (0,29 Mio. Lesepaare) alle Lesepaare verwendeten, da sie vorhanden waren waren weniger als 0,3 M. Die Bakterienarten, aus denen die Scheingemeinschaft besteht, und detaillierte Ergebnisse sind in den Ergänzungstabellen S4–S6 aufgeführt. Blau und Rot zeigen MDA-in-AGM bzw. FACS-MDA an. Quadrate, Kreise und Rauten kennzeichnen jeweils grampositive, gramnegative und gramvariable Bakterien.

SAGs von MDA-in-AGM mit > 5 % Kontamination, die entweder durch kontaminierende extrazelluläre DNA oder durch die Einkapselung mehrerer Zellen in einem einzelnen AGM verursacht würden, wurden mithilfe von metaWRAP31 in jede Bakterienart einsortiert, wobei zwischen kontaminierender DNA und DNA von unterschieden wurde Es war schwierig, mehrere Zellen einzufangen. Als Ergebnis wurden 30 zusätzliche SAGs mit <5 % Kontamination erhalten, und ihre Genomvollständigkeit und Kontaminationsraten betrugen 73,5 % (Median) bzw. 0,9 % (Median) (Ergänzungstabelle S8).

Die DNA-Umordnung während der MDA, also die Bildung von Chimären, kann den De-novo-Zusammenbau von Einzelzellgenomen erschweren32. In E. coli-SAGs waren die Raten chimärer Lesevorgänge bei MDA-in-AGMs (6,28 % ± 1,09 %) etwas höher als bei FACS-MDAs (4,49 % ± 1,32 %) (Welch-t-Test, P < 0,01; Ergänzungstabelle). S3). In SAGs aus der Schein-Community waren die Raten chimärer Lesevorgänge bei MDA-in-AGM (8,22 % ± 2,28 %) höher als bei FACS-MDA (3,55 % ± 1,07 %) (Welch-t-Test, P < 0,01; Ergänzungstabellen). S5, S6). Diese Raten chimärer Lesevorgänge in MDA-in-AGM waren ähnlich oder leicht höher als die Rate von 6,19 % in einer früheren Studie, bei der eine herkömmliche MDA-Methode zur Sequenzierung menschlicher haploider Genome verwendet wurde33.

Schließlich haben wir MDA-in-AGM auf eine natürliche Umweltprobe angewendet. Wir verwendeten die Mikrobiota im Darm der Termite Reticulitermes speratus, die mehrere hundert Bakterienarten aus verschiedenen Phyla umfasst34. Die Mikrobiota des Termitendarms hat Forscher vor allem wegen des komplexen symbiotischen Systems angezogen, das den hocheffizienten Abbau pflanzlicher Biomasse ermöglicht35,36,37. Die Mikrobiota des Termitendarms eignet sich auch hervorragend für eine Benchmarking-Studie unter Verwendung einer natürlichen Umweltprobe, da ihre Bakteriengemeinschaftsstruktur innerhalb einer Termitenart sehr konsistent ist und gut charakterisiert wurde34,36,38,39 und darüber hinaus die vollständigen Genomsequenzen dominant sind Es wurde über Bakterienarten im Darm von R. speratus berichtet40,41,42.

Die gesamten Eingeweide von fünf Arbeitertermiten wurden entfernt und der Darminhalt suspendiert. Dann wurden Bakterienzellen bei 18.000 × g für 5 Minuten durch Zentrifugation gesammelt, nachdem die extrazelluläre DNA mit DNase I verdaut wurde, und die Zellen wurden wie zuvor beschrieben mit sterilem Wasser gewaschen43. Die weiteren Vorgehensweisen waren die gleichen wie oben beschrieben. Um MDA-in-AGM anhand von Umweltproben aus den Termitendärmen zu bewerten, analysierten wir 48 SAGs, die durch MDA-in-AGM erhalten wurden. Die SAGs zeigten eine hohe Genomvollständigkeit (78,6 % ± 18,2 %) und eine niedrige Kontaminationsrate (1,0 % ± 1,0 %) (Tabelle 1). Die SAGs wurden mithilfe des Genome Taxonomy Database Tool Kit (GTDB-Tk)44 taxonomisch klassifiziert und waren 13 Bakterienklassen zugeordnet, darunter bekannten dominanten Gruppen im Termitendarm, Spirochaetia, Bacteroidia, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria und Clostridia34,38 . Im Gegensatz dazu betrug die Vollständigkeit des Genoms der durch FACS-MDA erhaltenen SAGs nur 37,7 % ± 19,0 % (n = 161). Obwohl für letzteren Fall eine andere Sequenzierungsmethode, nämlich eine Kombination aus dem Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) und der Illumina HiSeq 2500-Plattform (500 Zyklen), verwendet wurde, war die Anzahl der für die Assemblierung verwendeten Reads (Basen) hoch im Durchschnitt größer (551 Mb ± 64 Mb, n = 161) als in der Analyse der durch MDA-in-AGM erhaltenen SAGs (256 Mb ± 49 Mb, n = 48) (Ergänzungstabelle S9).

Zusätzlich zu den 48 SAGs analysierten wir 18 SAGs der Klasse Endomicrobia mit kleinen Genomgrößen (~ 1 MB)40, die durch MDA-in-AGM erhalten wurden, und es wurde eine Genomvollständigkeit von 91,2 % ± 9,8 % erreicht. Darüber hinaus wurden acht SAGs des Phylotyps Rs-D17 mit den zuvor erhaltenen vollständigen Genomsequenzen verglichen40,41. Die durch Kartierung von Reads auf die beiden Genomovare von Rs-D17 (Ri200840 und Ti200541) berechneten Genomabdeckungen erreichten 95,7 % ± 1,3 % bzw. 96,7 % ± 0,9 % (Ergänzungstabelle S10). Die Zusammensetzung der Termitendarmgemeinschaft wurde anhand von SAGs geschätzt, die durch MDA-in-AGM- oder 16S-rRNA-Amplikonanalyse erhalten wurden (Ergänzungstabelle S11). Die taxonomische Zusammensetzung der SAGs zeigte eine hohe positive Korrelation (R = 0,834, P < 0,01; Pearson-Korrelationskoeffizient) mit der 16S-rRNA-Amplikonanalyse, wohingegen die Häufigkeit grampositiver Bakterien in den SAGs geringer war.

MDA-in-AGM, das aus massiv parallelen MDAs in den AGM-Kernen im Pikolitermaßstab bestand, verbesserte die Genomvollständigkeit der SAGs von E. coli, einer Scheingemeinschaft menschlicher Darmbakterien, und Bakterien im Termitendarm im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren drastisch Mikroliterwaage FACS-MDA. Unter anderem werden die SAGs mit hoher Abdeckung, die mithilfe von MDA-in-AGM aus Termiten-Darmbakterien gewonnen werden (Tabelle 1, Ergänzungstabelle S9), zum Verständnis des komplexen symbiotischen Darmsystems und der Mechanismen des hocheffizienten Lignozellulose-Zersetzungssystems beitragen34, 36,40,41,43. Somit kann diese Methode die Stoffwechselkapazität noch nicht kultivierter Prokaryoten in Umgebungen wie dem Darmtrakt von Tieren, dem Boden und der Hydrosphäre aufdecken.

Über die Verbesserung der Genomvollständigkeit in der Einzelzellgenomik durch Reduzierung des Reaktionsvolumens von MDA mithilfe von Mikrofabrikationstechniken wurde bereits berichtet10,15,17,20,45, und die Vergleiche von MDA-in-AGM mit diesen anderen MDA-Methoden sind in dargestellt Ergänzungstabelle S12. Obwohl eine hohe Vollständigkeit des Genoms auch mit anderen miniaturisierten MDA-Methoden erreicht wird, erfordert MDA-in-AGM keine spezielle Ausrüstung und bietet eine skalierbare Probenvorbereitung. Darüber hinaus steigerte die Verwendung eines Alginat-Sol-Kerns erfolgreich die MDA-Ausbeute, was zur Eliminierung eines zweiten MDA-Schritts20,45 und damit zu einer geringeren Amplifikationsverzerrung und einem einfacheren Arbeitsablauf führte. Diese hohe Ausbeute ist wahrscheinlich auf die erhöhte Diffusionsfähigkeit der amplifizierten DNA im Solkern zurückzuführen. Unser MDA-in-AGM ist sowohl auf grampositive als auch auf gramnegative Bakterien und auch auf Genome mit hohem GC-Gehalt anwendbar (Abb. 4). Weitere Vorteile des AGM sind seine physikalische Stabilität und Durchlässigkeit für kleine Moleküle, die den Pufferaustausch und die physikalische Handhabung des Breis erleichtern.

Die Bildung chimärer Sequenzen während der MDA kann die Effizienz und Präzision des De-novo-Zusammenbaus von SAGs beeinträchtigen. In der Schein-Community waren die Raten chimärer Lesevorgänge vergleichbar mit denen bei Tröpfchen-MDA19 und etwas höher als bei herkömmlichen MDA-Methoden (Ergänzungstabelle S12)33. Da die Bildung von Chimären wahrscheinlich auf die Verzweigungsmigration amplifizierter DNA32 zurückzuführen ist, kann eine höhere MDA-Reaktionstemperatur durch Verwendung der thermostabilen phi29-DNA-Polymerase14 eine fehlerhafte Hybridisierung zwischen Replikons verringern.

Die Einheitlichkeit der Alginatkerngrößen, die den MDA-Reaktionsvolumina entsprechen (Ergänzungstabelle S1), könnte die Ausbeuten an DNA-amplifiziertem AGM, die Einheitlichkeit der Mengen an MDA-Produkten und die Qualität der AGM-Bibliotheken beeinflusst haben. Obwohl für AGM-Präparate Alginatkerne mit einem Durchmesser von < 100 µm verwendet wurden, würde eine engere Größenauswahl der Alginatkerne, beispielsweise 20–40 µm Durchmesser, die Gleichmäßigkeit der AGM-Kerne verbessern. Extrusion48 und Mikrokanäle17,18,19 würden auch die Gleichmäßigkeit des AGM-Kerns ohne Größenauswahl verbessern. Allerdings wird die Einführung dieser Prozesse den Arbeitsablauf verkomplizieren und die Kosten erhöhen.

Das manuelle Auswahlverfahren mit einem Mikromanipulator ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Einzelzellgenomik mit MDA-in-AGM. Um den Durchsatz zu erhöhen, kann die AGM-Sortierung mithilfe von FACS oder molekularer Barcodierung49 von SAGs angepasst werden, obwohl diese Ansätze auch die Einfachheit und Kostengünstigkeit des vorliegenden Protokolls verringern.

Die taxonomische Zusammensetzung der durch MDA-in-AGM erhaltenen SAGs stimmte weitgehend mit denen überein, die durch 16S-rRNA-Amplikon- und metagenomische Analysen gezeigt wurden; jedoch eine SAG der dominanten Fa. prausnitzii wurde weder im MDA-in-AGM noch im FACS-MDA wiederhergestellt (Ergänzungstabelle S4). Somit war dieser Fehler nicht spezifisch für die MDA-in-Hauptversammlung, sondern auf das MDA-Verfahren zurückzuführen. Ähnliche Diskrepanzen in der taxonomischen Zusammensetzung wurden bei grampositiven Bakterienklassen in Experimenten mit Termitendarmmikrobiota festgestellt (Ergänzungstabelle S11), sodass für bestimmte grampositive Bakterien möglicherweise eine Änderung des Zelllyseverfahrens, einschließlich der Zugabe von Lysozym, erforderlich sein kann. Obwohl wir es noch nicht versucht haben, diffundiert Lysozym mit einer Größe von 4 nm50 durch eine Agarose-Gelhülle, die aus 2 % niedrig schmelzender Agarose (Porengröße 200 nm)51 besteht, und lysiert die Bakterienzellwand im Kern. Um solche Bedingungen zu optimieren, ist AGM auch deshalb überlegen, weil der Austausch der Lösung im Vergleich zu anderen Methoden einfacher ist.

Die geringere durchschnittliche Genomvollständigkeit der Scheingemeinschaft (68 %) und des Termitendarmmikrobioms (79 %) im Vergleich zu der von E. coli (93 %) (Ergänzungstabellen S2, S5, Tabelle 1) kann auf die Unterschiede zurückzuführen sein die Leichtigkeit der Zelllyse. In früheren Studien wurde unabhängig von den MDA-Methoden über eine geringe Genomvollständigkeit von SAGs in bestimmten Bakterienlinien und Umweltproben im Vergleich zu SAGs von kultivierten E. coli berichtet1,52. Beispielsweise wurde bei Tröpfchen-Einzelzell-MDA festgestellt, dass die Genomvollständigkeit von E. coli und Bodenmikrobiota 96,5 % ± 2,2 % (n = 16) bzw. 52,8 % ± 24,3 % (n = 17) beträgt19. Die Optimierung der Zelllyse für verschiedene prokaryotische Stämme und Umweltproben ist ebenfalls wichtig, um die Vollständigkeit des Genoms zu erhöhen.

Kürzlich, während unsere Experimente liefen, wurde ein Bericht veröffentlicht, der zeigt, dass MDA eine Hohlkern-Hydrogel-Mikrokapsel verwendet, die aus einer vernetzten PEG-Gelhülle und einem Dextran-Sol-Kern besteht, einer Kapselstruktur ähnlich der AGM46. Obwohl die Amplifikationsverzerrung nicht bewertet wurde, erhöht Einzelzell-MDA im Kern die Menge an MDA-Produkt im Vergleich zu MDA im Gelkügelchen. Darüber hinaus verhindert die Hülle einer Hohlkern-Hydrogel-Mikrokapsel, dass genomische DNA nach alkalischer Denaturierung vor MDA aus dem Kern austritt. Nah-ultraviolettes Licht (365 nm), das zur photochemischen Vernetzung der PEG-Hülle verwendet wird, schädigt jedoch Zellen und DNA aufgrund von Photooxidation53. Wir haben Agarose als AGM-Hülle ausgewählt, weil sie eine thermisch milde reversible Gelierung ermöglicht, im Handel erhältlich ist und in Gegenwart von MDA-Reagenzien, insbesondere alkalischer Lösung, Neutralisationspuffer und EDTA, stabil ist.

AGMs oder andere Reaktionskammern, die einzelne Bakterienzellen enthalten, erzeugen zwangsläufig einen Anteil an Kammern, die mehrere Bakterienzellen enthalten21, und es ist schwierig, kontaminierende DNA in unseren experimentellen Verfahren vollständig zu eliminieren, wie auch in anderen zuvor entwickelten Methoden1. Dennoch ermöglichte uns die Anwendung eines Computerprogramms zum Binning metagenomischer Fragmente, wie etwa metaWRAP31, die Wiederherstellung einer beträchtlichen Anzahl von SAGs mit mindestens mittlerer Qualität aus Mini-Metagenom-Bins, die aus mehreren Zellen resultierten, indem kontaminierende Sequenzen entfernt wurden (Ergänzungstabelle S8). .

In den letzten Jahren wurde über zahlreiche Studien berichtet, die aus Metagenomen zusammengesetzte Genome aus Umweltproben analysierten54. Obwohl die Einzelzellgenomik verschiedene Vorteile bietet und möglicherweise die Qualität der Forschung in Kombination mit der Metagenomik steigert, beispielsweise durch die Aufdeckung von Heterogenität auf Stammebene55 und durch die Bereitstellung von Informationen über horizontal übertragene genetische Komponenten45, ist sie für viele Mikrobiologen schwierig durchzuführen. MDA-in-AGM ist eine viel einfachere und kostengünstigere Methode der Einzelzellgenomik und darüber hinaus wird nur eine kleine Probenmenge benötigt. Somit eignet sich diese Methode auch für winzige Präparate, etwa den Darmtrakt kleiner Insekten und Protistenzellen mit endo- und ekto-symbiotischen Bakteriengemeinschaften.

Für alle selbst hergestellten Lösungen wurde hochreines DNase/RNase-freies destilliertes Wasser (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) verwendet. Die Lösungen wurden 15 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert und durch UV-Strahlung bei 7,2 mW/cm2 über Nacht (12 Stunden) in einem Laminar-Flow-Schrank weiter dekontaminiert.

Eine Suspension einheitlicher CaCO3-Nanopartikel (9,4 % w/v, 100 nm Durchmesser, pH 10) wurde von Shiraishi Central Laboratories (Hyogo, Japan) bereitgestellt. Die Leitfähigkeit und der pH-Wert der CaCO3-Suspension wurden durch Waschen der Partikel mit drei Volumina Wasser verringert. Zusätzlich zu Shiraishis CaCO3 wurde auch feines Calciumcarbonat wie gefälltes Calciumcarbonat BioUltra (ca. 3 µm Durchmesser; Sigma, St. Louis, MO) für die Alginatkerngelierung verwendet. Eine Alginatlösung (5 %, w/v) wurde durch Auflösen von Natriumalginat (80–120 cP bei 1 %, w/v; Wako, Osaka, Japan) in Wasser hergestellt und bei 4 °C gelagert. Die Agaroselösung wurde durch Auflösen von SeaPlaque (endgültige 2 %, w/v; Lonza, Basel, Schweiz) in Wasser hergestellt und bei 4 °C gelagert. Als verwendet wurden Polyglyceryl-6-Octacaprylat (PGO; Nisshin Oillio, Tokio, Japan), Tris-EDTA-Puffer (TE; BioUltra für Molekularbiologie, pH 7,4; Sigma) und REPLI-g UltraFast Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland). nachstehend beschrieben.

Nachdem eine Agaroselösung (2 ml) mit PGO oder ISA, die jeweils 0,25 % Sorbitanmonooleat (Span 85; Wako) (v/v) (20 ml, 35 °C) enthielten, gemischt wurde, wurden durch Vortexen Agarosekügelchen auf Eis geliert wurden wie unten beschrieben aus PGO oder ISA gewonnen. Große Agaroseaggregate wurden mit 300-µm-Zellsieben (pluriSelect, Leipzig, Deutschland) von den Agarosekügelchen entfernt. Die Agarosekügelchen wurden unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop (IX71; Olympus, Tokio, Japan) beobachtet, das mit einer CCD-Kamera (BU-51LN; Bitran, Saitama, Japan) ausgestattet war. Die Durchmesser der Agarosekügelchen über einem Pixel auf den Bildern (1,28 µm) wurden mit ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) gemessen. Die Ausbeuten und Durchmesser der Agarosekügelchen wurden statistisch mit R (https://www.r-project.org/) analysiert.

Escherichia coli DH5α (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan) aus einer einzelnen Kolonie auf einer LB-Platte wurde in zwei Flaschen mit LB-Medium (200 ml) kultiviert. Anschließend wurden E. coli-Zellen geerntet und zweimal in PBS (20 ml) durch Zentrifugation gewaschen. Die Zellen wurden in PBS (10 ml) resuspendiert und ihre Dichte mit einer Zellzählkammer bestimmt. Die E. coli-Zellen (3,05 × 1010 Zellen/ml) wurden in Aliquots in Mikroröhrchen (jeweils 0,5 ml) aufgeteilt und bei –80 °C gelagert. Wie unten erwähnt, wurden einzelne Zellen von E. coli, die Scheinprobe und das Termitendarm-Mikrobiom unter Verwendung von bei –80 °C gelagerten Zellen, einer bei –80 °C gelagerten Mischung aus Glycerinvorräten und lebenden Proben aus Termitendärmen analysiert. jeweils.

Escherichia coli-Zellen wurden durch die Emulgierungs-/interne Gelierungsmethode in Alginatkerne eingekapselt27 (Abb. 1b). E. coli-Zellen aus der Stammkultur (10 µL) wurden mit 990 µL 2 %iger Natriumalginatlösung, die 1 % CaCO3 und 50 mM Acetatpuffer (pH 7,0, Sigma) enthielt, gemischt. Die Mischung wurde mit 9 ml Isostearylalkohol (ISA; Kokyu Alcohol Kogyo Co., Ltd., Chiba, Japan) mit 3 % Lecithin (Wako) in einem 50-ml-Röhrchen durch einminütiges Vortexen emulgiert. Die Emulsion wurde mit 2 % Essigsäure in ISA (jeweils 0,1 ml) durch zehnmaliges Vortexen für jeweils 1 Minute gemischt. Während dieses Vorgangs sank der pH-Wert der Mischung allmählich auf 4,0 und die CaCO3-Nanopartikel wurden gelöst. Die freigesetzten Calciumionen aus CaCO3 gelierten die Alginat-Mikrotröpfchen in der Emulsion. ISA wurde durch Mischen mit 9 ml Diethylether und 3-minütiges Zentrifugieren bei 4 °C unter Verwendung eines Schwingrotors (3000 × g, 5702R, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) entfernt. Das restliche ISA wurde durch Mischen mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 0,2 % (v/v) Tween 20 (Tris-Tween 20) (5 ml) enthielt, und anschließendes Zentrifugieren weiter von den Alginatkernen entfernt durch zweimaliges Wiederholen des Vorgangs mit 1-Butanol (5 ml). Die resultierenden Alginatkerne wurden in einem Volumen 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) suspendiert und durch ein 100-µm-Zellsieb (pluriSelect) filtriert, um große Alginataggregate zu entfernen. Die filtrierten Alginatkerne wurden weiter mit Tris-HCl (pH 7,5) gewaschen und in 2-ml-Mikroröhrchen gesammelt. Das Volumen der Alginatkerne wurde aus ihrem Gewicht berechnet und nach dem Mischen mit einem halben Volumen Tris-HCl (pH 7,5) bei 4 °C gelagert. Um die Anzahl der E. coli-Zellen in einem einzelnen Alginatkern auf weniger als zwei einzustellen, wurden 10 µL 3,05 × 106–108 E. coli-Zellen aus dem E. coli-Stamm mit 990 µL der alginathaltigen CaCO3-Suspension gemischt. Nachdem aus der Mischung Alginatkerne mit E. coli hergestellt wurden, wurden E. coli in den Alginatkernen unter Verwendung von SYBR Green I (TaKaRa Bio Inc.) beobachtet (ergänzende Abbildung S7). Bei 3,05 × 106 Zellen/ml der Alginatmischung enthielten 17,6 % der Kerne E. coli und 78,8 % davon enthielten einzelne Zellen. Daher wurden in nachfolgenden Experimenten 3,05 × 106 Zellen/ml E. coli für die Herstellung des Alginatkerns verwendet.

Der Überstand der Alginatkernsuspension (600 µL) wurde nach Zentrifugation in einem 50-ml-Röhrchen entfernt. Die restlichen Alginatkerne (400 µL) wurden mit der oben hergestellten Agaroselösung (2 ml) gemischt. Die Mischung wurde mit 0,25 % (v/v) Span 85 in PGO (20 ml) durch einminütiges Vortexen emulgiert (Abb. 1b). Die Alginatkerne, die Agaroselösung und das PGO wurden 10 Minuten lang bei 35 °C vorinkubiert, um die Bildung gelierter großer Agaroseaggregate zu verhindern. Anschließend wurde die Agarose durch einstündiges Abkühlen auf Eis geliert. PGO wurde wie oben beschrieben durch Waschen aus der Emulsion entfernt. Der Alginat-Gelkern wurde durch Chelatisierung von Calciumionen unter Zugabe von 1/10 Volumen 0,5 M EDTA (Thermo Fisher Scientific) isoliert. Die AGMs wurden dann in einem Volumen TE-Puffer suspendiert. Große Rückstände in der Suspension wurden durch ein 300-µm-Zellsieb entfernt und die AGMs wurden weiter mit TE gewaschen. Die AGMs wurden in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) verdünnt, das 0,5 % SeaPlaque-Agarose, 0,1 % p-Phenylendiamin (Wako) und 10.000-fach verdünntes SYBR Green I (TaKaRa Bio Inc.) enthielt, und die Morphologie und Dichte bestimmt , Durchmesser und Anzahl der eingekapselten E. coli-Zellen wurden wie oben erwähnt beobachtet. Die Hauptversammlungen wurden bei 4 °C gelagert. Für eine Langzeitlagerung (mehr als eine Woche) wurden die AGMs in 40 % Ethanol bei –80 °C gelagert und vor der Verwendung dreimal in zehn Volumina Wasser gewaschen. Die Qualität der genomischen DNA von AGMs, die in 40 % EtOH gelagert wurden, wurde durch deren Amplifikation mit MDA bestätigt.

Alginat-Gelkerne ohne E. coli wurden mit Rhodamin 123 (Wako) unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., TCI, Tokio, Japan) und N-Hydroxysuccinimid markiert ( Wako)56. AGMs, die mit Rhodamin 123 markierte Kerne enthielten, wurden in Gegenwart von 50 mM EDTA oder 50 mM CaCl2 5 Minuten lang auf 65 °C erhitzt. Restkerne wurden wie oben erwähnt beobachtet.

Aliquots (50 µL) der AGMs, die E. coli-Zellen enthielten, wurden vor der Solierung der Alginatkerne mit einem Volumen Zelllyselösung, enthaltend 400 mM KOH mit oder ohne 10 mM EDTA, gemischt und mit 100 µL Stopppuffer von neutralisiert REPLI-g UltraFast Mini Kit. Die AGMs, die E. coli enthielten, die AGMs ohne E. coli (Negativkontrolle) und die Agarosekügelchen, die E. coli enthielten (Kontrolle), wurden wie unten beschrieben einer MDA unterzogen und ihre amplifizierten DNAs wurden beobachtet.

Ein 50-µl-Aliquot der AGMs wurde zentrifugiert und die gesammelten AGMs wurden mit 200 µl Wasser gewaschen. Zelllyse und DNA-Denaturierung wurden mit Puffer D2 (50 µL) des REPLI-g UltraFast Mini Kit 30 Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem die Denaturierung mit dem Stopppuffer (50 µL) gestoppt wurde, wurde der Überstand durch Zentrifugation entfernt. Der Reaktionspuffer (93,5 µL) mit 11 µL Phi29-DNA-Polymerase aus dem Kit wurde hinzugefügt und 3 Stunden lang bei 30 °C inkubiert (MDA-in-AGM). Die Reaktion wurde mit 1/10 Volumen 0,5 M EDTA gestoppt und die AGMs wurden dreimal mit 200 µL TE-Puffer gewaschen. Die gewaschenen AGMs wurden bei 4 °C gelagert.

Als Kontrolle wurde Einzelzell-MDA unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers MoFlo XDP (Beckman Coulter Inc., Brea, CA) durchgeführt43. Nach E. coli wurden die Scheinbakteriengemeinschaft und die Termitendarmbakterien mit SYBR Green I oder CellTracker Green (Thermo Fisher Scientific) gefärbt und die gefärbten Bakterien wurden in eine einzelne Zelle pro Vertiefung von PCR-Platten mit 96 Vertiefungen sortiert. Die Zelllyse wurde mit Puffer D2 (1,5 µL) des REPLI-g UltraFast Mini Kits bei Raumtemperatur für 30 Minuten durchgeführt. Nachdem die Denaturierung mit dem Stopppuffer (1,5 µL) gestoppt wurde, wurde Reaktionspuffer (7,5 µL) mit 0,5 µL Phi29-DNA-Polymerase aus dem Kit hinzugefügt und 3 Stunden bei 30 °C und 15 Minuten bei 65 °C inkubiert. Um die Genomamplifikation und den Grad der Kontamination zu überprüfen, wurden die MDA-Produkte durch direkte Sanger-Sequenzierung der 16S-rRNA bewertet. Die PCR wurde mit Bacteria-universal 16S rRNA-Genprimern durchgeführt: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) und 1390R (5'-ACGGGCGGTGTGTACAA).

Eine Scheingemeinschaft menschlicher Darmbakterien wurde unter Verwendung von 15 Isolaten (Ergänzungstabelle S4) aus der Japan Collection of Microorganisms hergestellt. Als Scheinbakteriengemeinschaft wurde eine Mischung aller Glycerinvorräte in gleichen Mengen verwendet. Nachdem die Scheinbakteriengemeinschaft mit Wasser 100-fach verdünnt worden war, wurde das Verdünnungsmittel (10 µL) 30 Minuten lang bei 30 °C mit DNase I (20 µL) behandelt. Die Zellen wurden dreimal durch Suspendieren in Wasser (1 ml) gewaschen, durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 18.000 × g gesammelt und in Wasser (10 µL) suspendiert. Nach der oben beschriebenen MDA-in-AGM wurden die AGMs mit SYBR Green I unter einem Mikroskop beobachtet. Unter der großen Anzahl von AGMs im mikroskopischen Sichtfeld enthielten nur wenige AGMs amplifizierte DNAs, die mithilfe eines Mikromanipulators wie unten beschrieben isoliert wurden.

Um die Zusammensetzung der Scheinbakteriengemeinschaft zu bestimmen, wurde die Gesamt-DNA mit dem DNeasy Ultra Clean Microbial Kit (Qiagen) extrahiert. Die Metagenomsequenzierung wurde durch die Erstellung einer Bibliothek mit dem QIAseq FX DNA Library Kit (Qiagen) durchgeführt. Die Amplikonsequenzierung von 16S-rRNA-Genen in der Scheingemeinschaft wurde ebenfalls durchgeführt, indem eine Bibliothek mit den Indizes Nextera XT Index Kit 96 (Illumina, Inc., San Diego, CA) und der MiSeq-Plattform mit Reagent Kit V3 (600 Zyklen) erstellt wurde. Die bakterielle Zusammensetzung der Scheingemeinschaft wurde auf der Grundlage der in QIIME257 analysierten Ergebnisse geschätzt.

Exemplare der holzfressenden Termite Reticulitermes speratus wurden in Tsukuba in der Präfektur Ibaraki, Japan, gesammelt. Die Eingeweide von fünf Arbeitertermiten wurden entfernt und der Darminhalt in Lösung U58 suspendiert, die aus 9,2 mM NaHCO3, 5,1 mM Trinatriumcitrat-Dihydrat, 13 mM KH2PO4, 37 mM NaCl, 0,75 mM CaCl2 und 0,4 mM MgSO4 bestand. Die extrazelluläre DNA und die Protisten-DNA wurden mit DNase I verdaut, und die Bakterienzellen wurden 5 Minuten lang bei 18.000 × g durch Zentrifugation gesammelt und wie oben erwähnt mit Wasser gewaschen43. Die gewaschenen Termitendarmbakterien wurden in Wasser (10 µL) suspendiert. MDA-in-AGM für die Termitendarmbakterien wurde unter Verwendung der Suspension als Scheingemeinschaft durchgeführt.

AGMs, die amplifizierte DNA enthielten und mit SYBR Green I nachgewiesen wurden, wurden einzeln in PCR-Röhrchen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop übertragen, das mit einem Mikromanipulator (TransferMan NK2; Eppendorf, Hamburg, Deutschland) ausgestattet war. Zu jedem PCR-Röhrchen wurde mit einem einzelnen AGM Wasser (29 µL) gegeben und 5 Minuten lang bei 60 °C inkubiert, um DNA durch Solierung der Agarosehülle freizusetzen. Um den Grad der Kontamination zu überprüfen, haben wir die MDA-in-AGM-Produkte durch direkte Sanger-Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens wie oben erwähnt gescreent. Nach der Entfernung der kontaminierten Proben wurden Sequenzierungsbibliotheken mit dem QIAseq FX DNA Library Kit erstellt. Da die MDA-Produkte in AGM-Kernen zu klein waren, um quantifiziert zu werden, wurden die Fragmentierungs- und Ligationszeiten bei der Bibliothekskonstruktion unter der Bedingung einer Input-DNA von < 10 ng in den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Genomsequenzierung wurde auf der MiSeq-Plattform mit Reagent Kit V3 (600 Zyklen) durchgeführt. Sequenzbibliotheken für einzelne Zellen, die mithilfe von FACS aus der Termitendarm-Mikrobiota isoliert wurden, wurden mit dem Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) erstellt und auf der Illumina HiSeq 2500-Plattform (500 Zyklen) analysiert.

Die generierten kurzen Lesevorgänge wurden mit Cutadapt (https://github.com/marcelm/cutadapt), PRINSEQ (http://prinseq.sourceforge.net/), FASTX Trimmer und FASTQ Quality Trimmer (http://hannonlab.cshl) zugeschnitten .edu/fastx_toolkit/download.html) und cmpfastq_pe (http://compbio.brc.iop.kcl.ac.uk/software/download/cmpfastq_pe). Die getrimmten Lesevorgänge wurden mit SPAdes Version zusammengestellt. 3.13.0 (k-mer: 21, 33, 55, 77, 99 und 127, Optionen: -sc, -careful)28 in Contigs. Für die nachfolgenden Analysen wurden mit dem SeqKit (https://bioinf.shenwei.me/seqkit/) nur Contigs mit mehr als 1 kb ausgewählt.

Die taxonomische Klassifizierung von Einzelzellgenomen aus Termitendarmproben wurde mit dem Genome Taxonomy Database Tool Kit (GTDB-Tk)44 durchgeführt. Genomsequenzdaten, die eine Kontamination von > 5 % aufwiesen und mit CheckM29 identifiziert wurden, wurden nacheinander Binning-, Verfeinerungs- und Reassemblierungsprozessen mit den Modulen BINNING (einschließlich metaBAT259, MaxBin260 und CONCOCT61), BIN_REFINEMENT und REASSEMBLE_BINS von metaWRAP31 unterzogen.

Für Einzelzell-Genomanalysen unter Verwendung von E. coli DH5α und menschlichen Darmbakterien mit zunehmender Abdeckung (Abb. 3) wurden mit Trimmomatic62 durch Adapter beschnittene Lesevorgänge zufällig mit Rasusa63 ausgewählt und mit SPAdes28 de novo zusammengesetzt. Die Vollständigkeit des Genoms und die Anzahl der Contigs in den Assemblies wurden mit CheckM29 bewertet und mit R aufgezeichnet. Die Sequenzierungsablesungen, die unterschiedlichen Abdeckungen entsprachen, wurden mit Bowtie264 auf bekannte Genomsequenzen abgebildet, und die Ergebnisse wurden mit IGV Version als Heatmaps visualisiert. 2.3.26 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/). Das abgedeckte Genom (%), also die Genomregionen, die mit mindestens einem Lesevorgang pro 1-kb-Bin abgedeckt wurden, wurde mit BBtools (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/) berechnet.

Die Amplifikationsverzerrungen von SAGs wurden mithilfe von Gini-Koeffizienten und Lorenz-Kurven bewertet. Nachdem die Sequenzierungsablesungen von SAGs mithilfe von Bowtie264 auf Referenzgenome abgebildet wurden, wurden die Reads nach dem Zufallsprinzip so ausgewählt, dass sie eine 60-fache (E. coli) bzw. 40-fache (menschliche Darmbakterien) Abdeckung ihrer Genome aufwiesen, und daraus wurden die Sequenzierungstiefen pro Base berechnet Die Lesevorgänge erfolgen mit SAMtools (http://www.htslib.org). Gini-Koeffizienten von SAGs wurden aus mittleren Sequenzierungstiefen pro 50-kb-Bin unter Verwendung des R ineq-Pakets berechnet. SAGs, deren Gini-Koeffizienten ihren Medianen entsprachen, wurden mithilfe des R gglorenz-Pakets weiter auf Lorenz-Kurven aufgetragen.

Die chimäre Leserate wurde berechnet, indem kurze Lesevorgänge mit dem Barrows-Wheeler Aligner (https://sourceforge.net/projects/biobwa/files/) und SAMtools dem Referenzgenom zugeordnet wurden. Die Referenzgenome sind in der Ergänzungstabelle S4 aufgeführt. Kreuzkontaminationen von Genomsequenzierungsdaten mit einer Kontamination von < 5 % mithilfe von CheckM29 (Ergänzungstabelle S7) wurden berechnet, indem Sequenzierungsablesungen auf Referenzgenome in der Scheingemeinschaft abgebildet wurden16.

Die rohen Fastq-Dateien (DRR253532–DRR253885) und Baugruppen für SAGs von Termitendarmbakterien (BNTM01000000–BOCE01000000) wurden in DDBJ unter der BioProject-Zugangsnummer PRJDB10679 hinterlegt.

Woyke, T., Doud, DFR & Schulz, F. Der Verlauf der mikrobiellen Einzelzellsequenzierung. Nat. Methoden 14, 1045–1054 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wrighton, KC et al. Fermentation, Wasserstoff- und Schwefelstoffwechsel in mehreren unkultivierten Bakterienstämmen. Science 337, 1661–1665 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Albertsen, M. et al. Genomsequenzen seltener, nicht kultivierter Bakterien, die durch differenzielles Coverage-Binning mehrerer Metagenome erhalten wurden. Nat. Biotechnologie. 31, 533–538 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Anantharaman, K. et al. Tausende mikrobielle Genome geben Aufschluss über miteinander verbundene biogeochemische Prozesse in einem Grundwasserleitersystem. Nat. Komm. 7, 1–11 (2016).

Artikel Google Scholar

Delmont, TO et al. Stickstofffixierende Populationen von Planctomyceten und Proteobakterien sind in den Metagenomen der Oberflächenmeere reichlich vorhanden. Nat. Mikrobiol. 3, 804–813 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, K. et al. Sequenzierung von Genomen aus einzelnen Zellen durch Polymerase-Klonierung. Nat. Biotechnologie. 24, 680–686 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kaster, A.-K. & Sobol, MS Mikrobielle Einzelzell-Omics: Der Kern der Sache. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 104, 8209–8220 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Woyke, T. et al. Eine Bakterienzelle, ein vollständiges Genom. PLoS ONE 5, e10314 (2010).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fu, AY, Spence, C., Scherer, A., Arnold, FH & Quake, SR Ein mikrogefertigter fluoreszenzaktivierter Zellsortierer. Nat. Biotechnologie. 17, 1109–1111 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Marcy, Y. et al. Nanoliterreaktoren verbessern die Mehrfachverdrängungsamplifikation von Genomen aus einzelnen Zellen. PLoS Genet. 3, 1702–1708 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Joensson, HN & Andersson Svahn, H. Tröpfchen-Mikrofluidik – Ein Werkzeug für die Einzelzellanalyse. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 12176–12192 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Zong, C., Lu, S., Chapman, AR & Xie, XS Genomweite Detektion von Einzelnukleotid- und Kopienzahlvariationen einer einzelnen menschlichen Zelle. Science 338, 1622–1626 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dean, FB et al. Umfassende Amplifikation des menschlichen Genoms mittels Multiple Displacement Amplification. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 99, 5261–5266 (2002).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stepanauskas, R. et al. Verbesserte Genomwiederherstellung und integrierte Zellgrößenanalysen einzelner nicht kultivierter mikrobieller Zellen und Viruspartikel. Nat. Komm. 8, 84 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gole, J. et al. Massiv parallele Polymerase-Klonierung und Genomsequenzierung einzelner Zellen mithilfe von Nanoliter-Mikrotiterplatten. Nat. Biotechnologie. 31, 1126–1132 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, L., Brito, IL, Alm, EJ & Blainey, PC Virtuelle Mikrofluidik für digitale Quantifizierung und Einzelzellsequenzierung. Nat. Methoden 13, 759–762 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sidore, AM, Lan, F., Lim, SW & Abate, AR Verbesserte Sequenzierungsabdeckung mit digitaler Tröpfchen-Mehrfachverdrängungsverstärkung. Nukleinsäuren Res. 44, e66 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Nishikawa, Y. et al. Monodisperse Picoliter-Tröpfchen für Low-Bias- und kontaminationsfreie Reaktionen bei der Amplifikation des gesamten Genoms einzelner Zellen. PLoS ONE 10, e0138733 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Kogawa, M. & Takeyama, H. Massiv parallele Amplifikation des gesamten Genoms für die Einzelzellsequenzierung mithilfe von Tröpfchenmikrofluidik. Wissenschaft. Rep. 7, 5199 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chijiiwa, R. et al. Einzelzellgenomik von nicht kultivierten Bakterien zeigt, dass Ballaststoffe in der Darmmikrobiota von Mäusen ansprechen. Mikrobiom 8, 5 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bigdeli, S., Dettloff, RO, Frank, CW, Davis, RW & Crosby, LD Eine einfache Methode zur Einkapselung einzelner Zellen in Alginat-Mikrosphären ermöglicht die direkte PCR und die Amplifikation des gesamten Genoms. PLoS ONE 10, e0117738 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rabanel, JM, Banquy, X., Zouaoui, H., Mokhtar, M. & Hildgen, P. Fortschrittliche Technologie bei Mikroverkapselungsmethoden für die Zelltherapie. Biotechnologie. Prog. 25, 946–963 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Siltanen, C. et al. Einstufige Herstellung von Hydrogel-Mikrokapseln mit Hohlkern für den Zusammenbau und die Kultivierung von Hepatozyten-Sphäroiden. Acta Biomater. 50, 428–436 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Breguet, V., Gugerli, R., von Stockar, U. & Marison, IW CHO-Immobilisierung in Alginat/Poly-L-Lysin-Mikrokapseln: Ein Verständnis von Potenzial und Grenzen. Cytotechnology 53, 81–93 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sakai, S., Hashimoto, I. & Kawakami, K. Herstellung von zellumschließenden Hohlkern-Agarose-Mikrokapseln durch Einspritzen von mit Wasser nicht mischbarem flüssigem Paraffin und Bildung embryoider körperähnlicher kugelförmiger Gewebe aus Maus-ES-Zellen, die in diesen Mikrokapseln eingeschlossen sind. Biotechnologie. Bioeng. 99, 235–243 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tamminen, MV & Virta, MPJ Einzelgen-basierte Unterscheidung einzelner mikrobieller Genome aus einer gemischten Population mikrobieller Zellen. Vorderseite. Mikrobiol. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00195 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Poncelet, D. Herstellung von Alginatkügelchen durch Emulgierung/interne Gelierung. Ann. NY Acad. Wissenschaft. 944, 74–82 (2001).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Bankevich, A. et al. SPAdes: Ein neuer Genomassemblierungsalgorithmus und seine Anwendungen für die Einzelzellsequenzierung. J. Comput. Biol. 19, 455–477 (2012).

Artikel MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parks, DH, Imelfort, M., Skennerton, CT, Hugenholtz, P. & Tyson, GW CheckM: Bewertung der Qualität mikrobieller Genome, die aus Isolaten, Einzelzellen und Metagenomen gewonnen wurden. Genomres. 25, 1043–1055 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gurevich, A., Saveliev, V., Vyahhi, N. & Tesler, G. QUAST: Qualitätsbewertungstool für Genomassemblierungen. Bioinformatik 29, 1072–1075 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uritskiy, GV, DiRuggiero, J. & Taylor, J. MetaWRAP – Eine flexible Pipeline für die genomaufgelöste metagenomische Datenanalyse. Mikrobiom 6, 158 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lasken, RS & Stockwell, TB Mechanismus der Chimärenbildung während der Multiple-Displacement-Amplifikationsreaktion. BMC Biotechnol. 7, 19 (2007).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tu, J. et al. Systematische charakteristische Untersuchung der Chimären, die bei der Mehrfachverdrängungsamplifikation durch erneute Analyse der Sequenzierungsdaten der nächsten Generation erzeugt werden. PLoS ONE 10, e0139857 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hongoh, Y., Ohkuma, M. & Kudo, T. Molekulare Analyse bakterieller Mikrobiota im Darm der Termite Reticulitermes speratus (Isoptera; Rhinotermitidae). FEMS Mikrobiol. Ökologisch. 44, 231–242 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ni, J. & Tokuda, G. Lignozellulose abbauende Enzyme aus Termiten und ihren symbiotischen Mikrobiota. Biotechnologie. Adv. 31, 838–850 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brune, A. Symbiotische Verdauung von Lignozellulose in Termitendärmen. Nat. Rev. Microbiol. 12, 168–180 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Hongoh, Y. et al. Genom eines Endosymbionten, der die N2-Fixierung mit der Cellulolyse in Protistenzellen im Termitendarm verbindet. Wissenschaft 322, 1108–1109 (2008).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Hongoh, Y. et al. Intra- und interspezifische Vergleiche der Bakterienvielfalt und Gemeinschaftsstruktur unterstützen die Koevolution von Darmmikrobiota und Termitenwirt. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 71, 6590–6599 (2005).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arora, J. et al. Die funktionelle Entwicklung der Darmmikrobiota von Termiten. Mikrobiom 10, 1–22 (2022).

Artikel Google Scholar

Hongoh, Y. et al. Vollständiges Genom des unkultivierten Termitenbakteriums der Gruppe 1 in einer einzelnen Wirtsprotistenzelle. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 105, 5555–5560 (2008).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Izawa, K. et al. Der Vergleich intrazellulärer „Ca. Endomicrobium trichonymphae“-Genomovare beleuchtet den Bedarf und den Verfall von Abwehrsystemen gegen fremde DNA. Genombiol. Entwicklung 8, 3099–3107 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuwahara, H., Yuki, M., Izawa, K., Ohkuma, M. & Hongoh, Y. Genom von 'Ca. Desulfovibrio trichonymphae‘, ein H2-oxidierendes Bakterium in einem dreigliedrigen symbiotischen System innerhalb einer Protistenzelle im Termitendarm. ISME J. 11, 766–776 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yuki, M. et al. Dominante ektosymbiotische Bakterien zellulolytischer Protisten im Termitendarm haben auch das Potenzial, Lignozellulose zu verdauen. Umgebung. Mikrobiol. 17, 4942–4953 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chaumeil, PA, Mussig, AJ, Hugenholtz, P. & Parks, DH GTDB-Tk: Ein Toolkit zur Klassifizierung von Genomen mit der Genom-Taxonomie-Datenbank. Bioinformatik. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btz848 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N. & Abate, AR Einzelzell-Genomsequenzierung im Ultrahochdurchsatz mit mikrofluidischer Tröpfchen-Barcodierung. Nat. Biotechnologie. 35, 640–646 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leonaviciene, G., Leonavicius, K., Meskys, R. & Mazutis, L. Mehrstufige Verarbeitung einzelner Zellen unter Verwendung semipermeabler Kapseln. Labor. Chip 20, 4052–4062 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rodrigue, S. et al. Amplifikation des gesamten Genoms und De-novo-Assemblierung einzelner Bakterienzellen. PLoS ONE 4, e6864 (2009).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gasperini, L., Mano, JF & Reis, RL Natürliche Polymere für die Mikroverkapselung von Zellen. JR Soc. Schnittstelle 11, 20140817 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, GX et al. Massiv paralleles digitales Transkriptionsprofiling einzelner Zellen. Nat. Komm. 8, 14049 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Diamond, R. Verfeinerung der Struktur von Hühnereiweiß-Lysozym im realen Raum. J. Mol. Biol. 82, 371–391 (1974).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Narayanan, J., Xiong, JY & Liu, XY Bestimmung der Porengröße von Agarosegelen: Absorptionsmessungen im Vergleich zu anderen Techniken. J. Phys. 28, 83–86 (2006).

CAS Google Scholar

Clingenpeel, S., Clum, A., Schwientek, P., Rinke, C. & Woyke, T. Rekonstruktion des Genoms jeder Zelle innerhalb komplexer mikrobieller Gemeinschaften – Traum oder Realität? Vorderseite. Mikrobiol. 5, 771 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Cadet, J., Douki, T. & Ravanat, J.-L. Oxidativ erzeugte Schädigung der zellulären DNA durch UVB- und UVA-Strahlung. Photochem. Photobiol. 91, 140–155 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nayfach, S., Shi, ZJ, Seshadri, R., Pollard, KS & Kyrpides, NC Neue Erkenntnisse aus unkultivierten Genomen des globalen menschlichen Darmmikrobioms. Natur 568, 505–510 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Merino, N. et al. Einzelzellgenomik neuartiger Actinobakterien mit dem Wood-Ljungdahl-Weg, der in einem Serpentinisierungssystem entdeckt wurde. Vorderseite. Mikrobiol. 11, e1031 (2020).

Artikel Google Scholar

Hermanson, GT Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996).

Google Scholar

Bolyen, E. et al. Reproduzierbare, interaktive, skalierbare und erweiterbare Mikrobiom-Datenwissenschaft mit QIIME 2. Nat. Biotechnologie. 37, 852–857 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trager, W. Die Kultivierung eines Cellulose verdauenden Flagellaten, Trichomonas termopsidis, und bestimmter anderer Termitenprotozoen. Biol. Stier. 66, 182–190 (1934).

Artikel Google Scholar

Kang, DD et al. MetaBAT 2: Ein adaptiver Binning-Algorithmus für eine robuste und effiziente Genomrekonstruktion aus Metagenom-Assemblys. PeerJ 7, e7359 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, Y.-W., Simmons, BA & Singer, SW MaxBin 2.0: Ein automatisierter Binning-Algorithmus zur Wiederherstellung von Genomen aus mehreren metagenomischen Datensätzen. Bioinformatik 32, 605–607 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Alneberg, J. et al. Einteilung metagenomischer Contigs nach Abdeckung und Zusammensetzung. Nat. Methoden 11, 1144–1146 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: Ein flexibler Trimmer für Illumina-Sequenzdaten. Bioinformatik 30, 2114–2120 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hall, MB Rasusa: Zufällige Teilstichprobensequenzierung liest bis zu einer bestimmten Abdeckung. J. Open Source Softw. 7, 3941 (2022).

Artikel ADS Google Scholar

Langmead, B. & Salzberg, SL Schnelle Lücken-Lese-Ausrichtung mit Bowtie 2. Nat. Methoden 9, 357–359 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Diese Arbeit wurde vom RIKEN Pioneering Project „Biology of Symbiosis“, den JSPS KAKENHI Grants 16K07224 an H. A und 17H01447 und 19H05679 an MO sowie dem Institute of Fermentation, Osaka an MY, unterstützt

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Hiroyoshi Aoki, Yuki Masahiro, Yuichi Hongoh, Moriya Ohkuma und Yutaka Yamagata.

Ultrahigh Precision Optics Technology Team, Advanced Photonics Technology Group, RIKEN Center for Advanced Photonics, 3-1, Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japan

Hiroyoshi Aoki und Yutaka Yamagata

Japan Collection of Microorganisms (JCM), RIKEN BioResource Research Center, 3-1-1, Koyadai, Tsukuba, Ibaraki, 305-0074, Japan

Yuki Masahiro, Michiru Shimizu, Yuichi Hongoh und Moriya Ohkuma

School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, Tokio, Japan

Yuichi Hongoh

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YY und MO überwachten die Studie. HA, MY, YH und MO haben die Studie entworfen. HA, MY und YH haben das Manuskript geschrieben. HA hat das Vorbereitungsprotokoll für die Hauptversammlung entwickelt. MY und MS führten die Sequenzierung des nächsten Genoms und die anschließenden Datenanalysen durch. Alle Autoren haben zum Manuskript beigetragen und es bearbeitet.

Korrespondenz mit Hiroyoshi Aoki oder Moriya Ohkuma.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Aoki, H., Masahiro, Y., Shimizu, M. et al. Agarosegel-Mikrokapseln ermöglichen eine einfach vorzubereitende Einzelzellgenomik im Picoliter-Maßstab und liefern Genomsequenzen mit hoher Abdeckung. Sci Rep 12, 17014 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20923-z

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Eingegangen: 19. Januar 2022

Angenommen: 21. September 2022

Veröffentlicht: 18. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20923-z

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